上海应用技术大学香料香精化妆品学部陈臣教授等/内酯类香料的微生物法转化制备及其调控研究进展

内酯类化合物<<<<

内酯类香料合成方法和特点<<<<

目的意义<<<<

其主要途径包括以几种脂肪酸或其衍生物为底物，在油酸转运至线粒体时通过微生物细胞内特别是线粒体内一系列关键酶(酯酶和β-氧化酶系)的作用经四步β-氧化，把相应底物氧化为乙酰-CoA，后乙酰-CoA进入循环彻底氧化，脱去碳原子单元，生成前体物质4-羟基酸。

脂肪酸进入线粒体共有如下几种方式：一、在脂肪酸转运蛋白的作用下进入线粒体；二、在脂肪酸移位酶的催化下以脂肪酸和脂肪酸结合蛋白结合物的形式进入；三、在酰基辅酶 A 合成酶的催化下脂肪酸合成脂酰辅酶 A，后在脂酰辅酶 A 结合蛋白或肉碱棕榈酰基转移酶和肉碱/酰基肉碱移位酶的作用下进入。

β-氧化是脂肪酸降解中经典的生化代谢路径，也是一个碳链缩短的生物化学反应。如图 1 所示，在脂酰-CoA脱氢酶的作用下，每一轮β-氧化过程都会切下两个碳原子单元即乙酰-CoA，然后乙酰CoA进入柠檬酸生产循环为细胞生物体生命活动提供所必需的能量。作为蓖麻油酸的十八碳化合物，其必须经过四步β-氧化循环后生成前体物4-羟基酸再进行环化形成内酯。

β-氧化过程包括以下四步反应：酰基辅酶A氧化酶催化的氧化反应；烯酰辅酶A氧化酶催化的水合反应；3-羟基辅酶A脱氢酶催化的脱氢反应；3-酮酰-CoA硫解酶催化的硫解反应。

内酯物质的环化过程是指羟基脂肪酸在环化酶的催化下通过分子内失去一分子水发生内酯化反应形成具有光学活性的环状化合物的过程，并为微生物的生长繁殖提供必要的能量。在内酯环状化合物中即使是非共轭的双键也可以被选择性的对应转化。常见催化酶有酰基辅酶A氧化酶和3-羟基酰辅酶A脱氢酶等

在利用蓖麻油酸生物转化制备内酯时，当产物浓度达到一个最高值后由于细胞对内酯的降解或再利用，会出现缓慢减少的现象。产物内酯的降解可能主要有以下三种途径：一是未内酯化的羟基酸降解速度比产物内酯的降解速度要快，这表明产物内酯的水解过程占主导控制地位。二是通过内酯酶的作用对产物内酯进行开环，后在β-氧化过程中将开环的产物进行氧化降解。三是产物内酯发生ω-氧化生成ω-二羧酸。

基于基因组学的基因调控是指基于基因组学技术，通过基因工程的方法从分子水平上对微生物进行操作，对其进行改造，敲除、扩增或添加某个基因片段，从而对微生物的相关理化性质及特征进行调控常被用来以微生物法转化制备内酯类香料的解脂耶氏酵母具有六个酰基辅酶A氧化酶家族—Aox1至6由Pox1至Pox6基因编码。

在解脂耶氏酵母野生型菌株制备内酯的过程中 ，内酯的积累与Aox的高效表达有关。其中 Aox2表现出长链特异性，Aox3表现出短链特异性，Aox4、Aox5和Aox6在直链酰基辅酶 A(从碳4到碳18)的整个光谱中表现出弱活性。

Pox1基因的破坏导致β-氧化活性增加，但内酯的产量会减少。学者们通过对降解途径中乙酰辅酶氧化酶Aox3的编码基因Pox3片段的敲除，或者对具有羟基脂肪酸长链特异性的乙酰辅酶氧化酶Aox2的编码基因Pox2的扩增表达，使所产内酯的生产回流和被基因编码降解效应减弱，内酯的产量有了不同程度的提高。还可利用基因同源重组法对尿嘧啶关键合成酶基因URA3进行敲除，从而构建尿嘧啶营养缺陷型解脂耶氏酵母来大幅提升内酯产量。

为选育高产内酯菌株，可采用诱变育种后再进行菌种筛选的方式。诱变育种按诱变因素可分为物理诱变和化学诱变。用化学或物理方法促进菌株细胞原生质体融合也是研究较多的一种菌种诱变育种方法，多种诱变因素一起诱变又称为复合诱变。通过对菌株中特定控制4-羟基癸酰辅酶A的羟基和-CoA基团的内部酯化反应以及醇和酰基辅酶A之间的酯化反应的酶基因进行突变，从而促进产物内酯的生产。

氧气传质速率代表着生物转化体系中的溶氧水平，氧气传质速率增加时，微生物的呼吸作用加强。因为微生物生长、β-氧化能力与产物内酯的形成相伴而生，所以溶氧浓度的增加和较好的培养基氧化状态能够有效提高菌株体内的β-氧化能力，从而提升菌株对底物的利用率。通过在发酵前期常压下增加曝气速率和搅拌速率，以及提高反应器内的空气压力即增加氧溶解度，可以有效提高气体到液体介质的氧传递速率，利于菌体生长。而在产物生成期则降低速率进行分段控制，低溶氧量则有助于产物内酯的积累。因此通过调整溶氧进而调控内酯类香料的转化程度在理论和实践上是可行的。

解脂耶氏酵母的β-氧化过程对培养基中溶氧浓度较为敏感，当氧气超过一定浓度时，3-羟基酰辅酶A脱氢酶在氧化过程中占主导作用，从而不利于细胞中内酯类化合物的产生。氧气浓度也影响着内酯类化合物的细胞内降解过程，较高氧气浓度可以促进内酯类化合物向 4-羟基酸的转化。因此为提高内酯化合物产率，应在产物内酯浓度较高时降低培养基中的氧气浓度。

在菌株发酵培养几个小时后底物完全耗尽，酵母细胞以γ-癸内酯为碳源消耗。因此，γ-癸内酯从培养基中完全消失，从而产物内酯生产率取决于增长率和消耗率之间的差异。底物分批培养可以作为其解决方法，当底物低于菌株消耗利用所需水平时，底物被间歇或连续地供应从而减缓了产物内酯的消耗率提升了内酯产量。不同种底物(如蓖麻油和蓖麻油酸甲酯)的添加方式影响着微生物法转化制备γ-癸内酯的产量，当通过底物分批进料培养发酵时内酯类香料的产量会有所提升。

限制生物制备内酯类香料工业化应用的另一主要因素是菌株细胞对内酯化合物浓度的升高较为敏感且产物内酯对菌株细胞具有一定的毒害作用。微生物细胞的固定化技术已被证实能为细胞提供一定的保护作用，通过将产物内酯与菌株细胞分离使其免受物理化学变化或抑制物质的影响。降低产物内酯对菌株的毒害作用及菌株对产物内酯的降解作用，并提高底物的利用率，加快发酵速度，延长细胞的活性和稳定性，从而提高菌株的内酯产量。研究表明，因为产物内酯对菌株细胞存在一定的毒害作用，所以微生物细胞在生物技术生产过程中细胞活性受到了影响。当内酯化合物浓度高于150mg/L时细胞生长易被抑制，细胞去极性化，膜流动性增加。

陈臣，目前共主持科研项目近20项，包括国家自然科学基金面上项目1项(31972197)，青年项目1项(31501451)，省部级项目5项，其他纵向4项，企业横向8项，总经费500余万。获得中国轻工业联合会科技进步一等奖(2021年，R2)和2014年上海市科学技术进步奖一等奖1项(2014年，R10)。以第1及通讯作者发表论文80余篇，其中SCI 40篇(二区以上25篇，他引>1200次)，EI13篇。共申请发明专利90余项，其中授权28项，主编教材1部，参编著作3部。