文章鉴读|青岛农业大学食品科学与工程学院 李兆杰教授团队：益生菌活性代谢产物的研究及应用进展

图  1  益生菌活性代谢产物、功能及应用

Figure  1.  Active metabolites of probiotics，functions and applications

1.7  胞外多糖的应用

目前，益生菌产生的胞外多糖可用作各种行业的功能性成分，如食品和制药工业。在食品工业中，EPS因其稳定、乳化或凝胶特性而被用作生物增稠剂。黄原胶是黄单胞杆菌产生的一种EPS，已作为乳化剂、增稠剂、悬浮剂等在乳及乳制品、饮料制品、调味品及冷冻饮品、烘烤食品、粮食制品等领域中得到广泛应用，以此增强食品的稳定性和提高食品的品质。在制药工业中，EPS因其具有良好的生物学特性且无毒副作用，可用作天然的抗菌剂、抗氧化剂和免疫调节剂等。然而，益生菌产生EPS的方式主要为天然菌种发酵，合成过程复杂、成本高，限制了其大规模工业化生产和应用。虽然大量研究已经证实EPS可以在体外或者动物体内发挥良好的功能特性，但是临床治疗上利用EPS完成治疗的案例仍然较少。因此，需要大量的科学研究来提高EPS的产量和体内治疗特性的研究，以充分开发EPS的潜力。 

2  细菌素

2.1  细菌素概述

细菌素是由细菌通过核糖体途径合成的蛋白类抗菌物质，一般由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和古细菌产生，具有杀死/抑制其他微生物的能力，且具有无抗药性、无残留、杀菌快等优点。乳酸菌细菌素是由乳酸菌发酵产生的多肽类物质，相对分子量较小，能抑制或杀死革兰氏阳性菌和腐败菌，也有部分乳酸菌细菌素对革兰氏阴性菌有明显的抑菌作用。另外，很多细菌素被报道还具有抗肿瘤、抗病毒等功能活性。根据乳酸菌细菌素的相对分子量、化学结构、热稳定性、抗菌谱等特征，乳酸菌细菌素可以分为四大类：第一类为羊毛硫细菌素，一般分子量低于50 kD，对热稳定，含有羊毛硫氨酸或者甲基羊毛硫氨酸, 如常见的乳酸链球菌素。产生菌一般为革兰氏阳性菌，如乳球菌属、链球菌属、微球菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属以及肠球菌属等；第二类是分子量低于10 kD的耐热细菌素，具有膜活性，如片球菌素pediocin PA -1。产生菌有乳酸片球菌、乳酸链球菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、清酒乳杆菌等；第三类是分子量大于30 kD的不耐热细菌素，可分为溶菌素和非溶菌蛋白，这类细菌素100 ℃加热30 min即失活。产生菌有瑞士乳杆菌、粪肠球菌等；第四类为复合细菌素，是含有脂质或与蛋白质结合的肽复合物，这类细菌素只有在复合物的状态下才能充分发挥活性。产生菌有乳球菌属、链球菌属、片球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属等。乳酸菌细菌素在食品防腐、医疗健康以及畜禽养殖领域具有巨大的应用潜力。

2.2  细菌素在食品防腐中的应用

近年来，食品中化学防腐剂对人体健康的影响引起了消费者的广泛关注。细菌素是一种安全的具有广谱抗菌活性的天然防腐剂，可通过成孔、抑制细胞壁/核酸/蛋白质合成等不同的作用方式有效地抵抗食源性病原体。研究发现由鼠李糖乳杆菌L. 1.0320中纯化出细菌素1.0320在靶细胞细胞膜上形成孔洞，增加细胞膜通透性，增加质子动力PMF的耗散，破坏细胞膜的完整性，导致胞内容物流出，诱导细菌死亡。与之类似的还有Hilal等从粪肠杆菌KT11中分离出的细菌素KT11具有广泛的抗菌谱、热稳定性和较宽的pH范围内的稳定性，可以作为天然的食品生物防腐剂。 

据报道，应用细菌素和产生细菌素的乳酸菌可以有效控制牛奶、酸奶和奶酪中的病原体，具有提高产品质量和安全性、延长保质期的重要作用。目前，乳酸乳球菌产生的细菌素——乳酸链球菌素（Nisin）已经实现了商业化生产，作为天然的食品防腐剂已被广泛用于乳、肉和罐头制品等食品中。含有Nisin的活性抗菌包装可以在加工或后加工过程中有效地控制奶酪污染。然而，细菌素在稳定性方面的局限性以及食品基质等的其他影响因素限制了其广泛应用。例如，Nisin只对革兰氏阳性菌发挥作用，而且主要在酸性条件下发挥作用。细菌素的这些局限性可通过改造细菌素并使其在热稳定性和pH稳定性、扩散率和其他所需特性方面更加稳定来克服。细菌素与纳米材料的结合可以提高细菌素的稳定性，扩大细菌素的应用范围。另外，生产和纯化成本也是阻碍细菌素应用的重要因素。一篇综述中提出，一些农用工业废物，如乳清、糖蜜、海洋副产品、大豆废料等，可作为高效低成本底物用于细菌素的生产。 

近期的研究表明，溶葡萄球菌素单独或联合Nisin对已建立的葡萄球菌生物膜的作用可能是控制牛乳腺炎的替代方法。由于Nisin和溶葡萄球菌素有不同的作用模式，这两种细菌素的组合比单一物质的使用有优势，联合使用有可能预防或治疗与葡萄球菌相关的感染。此外，Hu等发现加氏乳杆菌LA39和弗鲁姆蒂乳杆菌可以作为抗生素替代品来预防哺乳动物腹泻，其作用主要依赖于细菌分泌的名为zzz环状肽gassericin A的一种细菌素。有研究应用可产生双组分细菌素乳霉素3147的乳酸乳球菌DPC3147与液体石蜡、吐温80优化复配制成一种活性乳剂“活性生物制剂”，将其与商业抗生素配方TerrexineTM（卡那霉素和先锋霉素）进行比较。结果发现，在治疗患有临床/亚临床乳腺炎的奶牛疗效方面，这种“活性生物制剂”的治愈率与商业抗生素接近，且在生产难易性和成本方面均优于该商业抗生素配方，证明该产品可能是治疗牛乳腺炎的一种可行的替代选择。 

虽然细菌素是一种良好的抗生素替代物，但是目前只有Nisin在食品中得到广泛应用。产量低、分离纯化成本高是制约细菌素应用的重要因素。化学合成虽然是一个很好的策略，但是成本较高且产量低，不适合大规模工业化生产。因此，细菌素尚需大量研究开发来做支撑，寻找高抗菌活性（广谱抗菌、高效价）和高稳定性（耐热、耐受更宽pH范围）的细菌素、筛选细菌素高产菌株、优化细菌素高产及分离纯化工艺、对细菌素进行改造等是细菌素研究及开发应用的主要方向。 

3  有机酸

3.1  有机酸的概述

有机酸是益生菌的一种重要代谢产物，大部分乳酸菌都能产生多种有机酸，如植物乳杆菌、乳酸片球菌、鼠李糖乳杆菌、肠膜明串珠菌、嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌等，这些乳酸菌利用宿主体内未被分解消化的碳源，经发酵可以产生乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸，以及乳酸、苯乳酸、琥珀酸、苹果酸、丁二酸等多种有机酸。有机酸具有抑制致病菌、调节肠道菌群、增强肠道屏障、促进动物生长和调节免疫等功能。 

3.2  有机酸的应用

有机酸由于其具有降低肠道pH，抑制胃肠道病原菌的生长等益生特性常用于食品、饲料行业中的防腐防变。乳酸菌发酵产生的有机酸对提高食品的品质、保质期及安全性起着至关重要的作用，并且乳酸菌对病原菌及腐败菌的抑制作用也主要依赖其产生的多种有机酸。李书鸿等通过对云南传统发酵食品中分离出的18 株植物乳杆菌代谢产物的研究发现，其抑菌活性与植物乳杆菌菌株、病原指示菌及发酵碳源相关，且受上清液低pH的影响，有机酸是主要的抑菌物质。李洁等采用spot-on-lawn法及琼脂扩散法研究乳酸片球菌的抑菌活性，利用HPLC分析发酵液主要有机酸组分，发现乳酸片球菌以葡萄糖作为发酵碳源时发酵能力最强，且主要抑菌物质为有机酸。另外，接种肠膜明串珠菌发酵可以显著提高泡菜中有机酸的含量，提升泡菜的品质，缩短发酵周期。 

研究表明，有机酸也是一种非常好的动物饲料添加剂。日粮中添加有机酸还可显著提高猪回肠的蛋白质、氨基酸消化率和矿物质吸收率，还可减少氮和磷排泄，减少环境污染。有机酸可以通过改变肠道微生物组成，保护家禽免受病原体的侵害，缓解由于断奶应激造成的仔猪胃肠道功能紊乱，提高家禽的生产性能，减少养殖业的经济损失，有望成为抗生素的替代品。在鱼基青贮饲料的发酵过程中，各种乳酸菌菌株能够产生大量的有机酸。就质量安全性而言，在潮湿和喷雾干燥的鱼基青贮饲料中富集较高含量的有机酸更适合用于动物饲料。此外，益生菌及其有机酸的复合制剂添加到动物饲料中，并已被证实在促进动物生长、调节免疫等方面具有较好效果。如在一项饲养实验中发现饲粮中添加益生菌及有机酸复合制剂能够提高大骨鸡生长性能和免疫水平，对肉品质有一定的改善作用。在玉米-豆粕型日粮中添加益生菌和有机酸复合制剂提高了青脚麻鸡的生产性能、屠宰性能、消化酶活力，尤其是在低蛋白水平下效果更明显。郑文才等发现在饲粮中添加益生菌和有机酸复合制剂可以改善断奶仔猪肠道黏膜形态，提高肠道功能及部分免疫指标，缓解断奶应激引起的仔猪免疫功能下降，从而降低断奶仔猪腹泻率，提高饲料转化率。乳酸菌或有机酸处理还可改善玉米青贮品质，乳酸菌能更有效地提高乳酸含量，降低pH，有机酸则能抑制不良微生物的生长。Rodjan等研究发现在鸡日粮中添加有机酸和益生菌可以提高粗纤维和绒毛高度的消化能力，并在不损害生长性能的情况下降低肠道大肠杆菌的数量。综上所述，有机酸作为益生菌的活性代谢产物，用于畜牧养殖饲料中，具有拮抗致病菌、增强肠道屏障功能、促进营养吸收、促进动物生长、提高免疫等多种功能，与益生菌复配使用效果更佳。 

4  短链脂肪酸

4.1  短链脂肪酸的概述

短链脂肪酸（SCFAs）是含1～6个碳原子的有机羧酸，其中乙酸、丙酸和丁酸占所有SCFAs的90%。据报道短链脂肪酸提供了大约人类每日所需能量的10%。SCFAs在人体内提供多种有益作用，可以通过一些与肠道屏障功能、葡萄糖稳态、免疫调节、食欲调节、肥胖相关的组织特异性机制直接调节宿主健康，而且对多种疾病具有治疗作用，包括炎症性肠病、结肠癌、细菌性感染、糖尿病、精神疾病和心脏病等。乳酸杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和梭状芽孢杆菌等都可代谢产生SCFAs。 

4.2  短链脂肪酸的功能性

SCFAs是肠上皮细胞的重要组成部分，已知可增强肠道屏障功能。SCFAs和有机酸通过降低肠道的pH，抑制病原菌从而诱导产生抗菌活性，在维持肠道内环境平衡和能量代谢调节中起着重要作用。此外，SCFAs可能通过细胞表面G蛋白偶联受体（GPCR），如GPR41、GPR43和GPR109A来激活控制免疫功能的信号级联反应。在细胞水平上，SCFAs可直接或间接影响细胞增殖、分化和基因表达等过程。丁酸是影响肠上皮屏障的主要短链脂肪酸，具有维持肠道细胞完整、调节代谢等功能。丁酸盐可以促进细胞增殖和分化，刺激细胞凋亡，缓解肠壁氧化应激，共同促进粘膜健康。大量研究表明，SCFAs在肠道炎症中具有抗炎作用，抑制肠上皮炎症介质的活性，从而抑制NFκB巨噬细胞的活化，而NFκB巨噬细胞是炎症性肠病炎症过程中细胞因子的主要来源。另外，SCFAs还被证明具有抑制肿瘤发生的能力，但对正常细胞的繁殖没有明显影响，并对免疫系统具有调节作用。Ohara等研究发现SCFAs抗肿瘤活性的主要机制是抑制肿瘤生长和代谢功能，如细胞周期、DNA复制、重组和修复，而几乎不抑制肿瘤相关基因。 

4.3   短链脂肪酸的应用

近年来的研究表明，乳酸菌、双歧杆菌和梭状芽胞杆菌等产生的一些SCFAs等活性物质在各种精神疾病中具有非常特殊的功能，可能是潜在的新型精神生物制剂，其中发挥重要功效的一种物质就是γ-氨基丁酸（Gaba）。Gaba是一种四碳短链脂肪酸，具有多种生理活性，包括促进神经元发育、缓解焦虑和失眠、降压、降血糖、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗过敏、保护肝脏和肾脏、保护肠道等，是一种卓越的健康效应因子。早在2009年，Gaba就已被我国卫生部列为新资源食品。目前Gaba已实现产业化，并广泛用于各类食品和保健品中。 

研究表明，SCFAs还通过影响多种营养物质的消化吸收对机体产生积极作用。据报道，SCFAs浓度增加与肥胖相关的微生物成分有关。SCFAs刺激多种参与脂质和葡萄糖代谢的激素（如GLP-1、PYY和瘦素）进而影响食欲，从而影响能量摄入。SCFAs有利于增加矿物质溶解度和吸收，在调节pH、增加钙、铁、镁的吸收等方面发挥着非常重要的作用。琥珀酸是肠道糖异生的底物，已被发现可以改善小鼠的血糖控制。丙酸可以改善胰岛素敏感性和糖耐受，并改变脂质代谢。而丁酸可以上调谷胱甘肽，并益于健康人结肠中的氧化应激反应。此外，SCFAs在调节家畜生长性能方面有非常积极的影响，可以有效促进动物生长、增加肠绒毛长度和高度、减少脂肪增加和抑制炎症。Felizardo等研究发现添加富含SCFAs的纤维饲粮可为宿主提供较高水平的SCFAs，平衡高水平氨氮的影响，减少代谢和炎症疾病，恢复肠道生化环境。 

5  维生素

5.1  维生素的功能性

利用乳酸菌生产维生素可能是开发功能性发酵乳制品的一个重要策略。Subrota等从印度传统大米发酵食品中分离到5株乳酸菌，具有不同的B₂、B₉、B₁₂和短链脂肪酸高产性能，可应用于功能性发酵乳制品。利用能生产高营养素或微量营养素（如维生素）的乳酸菌还可以用来开发新型功能食品。一株从中国传统发酵酸菜中分离的干酪乳杆菌11MZ-5-1被证明可以显著提高酸菜中V_C的含量，加快产酸并显著降低亚硝酸盐浓度，同时还可以明显改善酸菜感官。 

除上述活性物质外，益生菌还代谢产生多种具有生物活性的酶及一些小分子。如益生菌会通过产生一些宿主中可能缺少的蛋白酶、脂酶、酯酶以及淀粉酶等帮助催化一些代谢反应。比较典型的是益生菌通过产生β-半乳糖苷酶和乳糖酶帮助宿主分解乳糖以缓解宿主乳糖不耐受。通过发酵蛋白质，益生菌可以产生一些小分子肽、氨基酸、酚类、内酯和吲哚类物质，在维持能量平衡、抗氧化、抗炎症，以及通过免疫信号传递拮抗病原微生物中发挥作用。有研究发现益生菌的活性代谢产物D-色氨酸可以有助于调理免疫反应、影响肠道微生物菌群结构并能减轻过敏性呼吸道疾病症状。还有研究用益生菌发酵牛奶制备具有抗高血压的功能性酸奶，而这种活性被证明主要是由于益生菌发酵牛奶蛋白产生的一些具有抗高血压活性的生物活性肽产生的。此外，益生菌还可以代谢产生5-羟色胺、多巴胺、乙酰胆碱等神经递质，以调控机体认知能力。 

益生菌代谢产生成千上万种物质，其中蕴含着已被发现以及尚未被发现的多种活性物质。益生菌活性代谢产物正在吸引越来越多的研究人员以及食品、医药、饲料、美容等多个行业的高度关注。虽然很多活性代谢产物有较好的功能，但目前益生菌活性代谢产物的使用仍存在一定的局限性，如胞外多糖、细菌素等活性代谢产物的合成过程复杂、产量低、生产纯化成本高，有些小分子活性物质作用机理不清。这些问题一定程度上限制了其大规模生产和应用。另外，很多活性物质的功能活性大都通过体外实验验证，尚需大量动物实验和临床实验进行验证。尽管如此，一些已经产业化的活性代谢产物给了我们足够的信心和希望，同时也提示我们在益生菌活性代谢产物开发研究及产业化领域仍需努力的方向。 

益生菌的很多活性代谢产物在功能上可能存在“协同”作用，在应用上或许不需要单独分离纯化使用。例如，在拮抗致病菌方面，益生菌可以产生细菌素、有机酸等多种抗菌物质，这些抗菌活性物质共同使用时效果更好。2021年5月，国家益生菌与和益生元科学协会（ISAPP）首次在全球范围发布了后生元的共识声明，提出后生元是指对健康有益的无生命微生物或其成分的制剂，包括益生菌的死菌体及其代谢产物，并强调后生元不是单一的活性物质，而是多种有益活性物质的混合物。基于后生元的多组分特性，后生元在生理功能上也具有“多功能性”，但后生元的功能同样需要大量体外实验、动物实验以及临床实验验证。因此，后生元的研究将会成为益生菌活性代谢产物研究领域另一个重要的发展方向。