文章鉴读|南京农业大学食品科技学院陆兆新教授：生姜多糖的提取及其对糖尿病小鼠肠道菌群的调节作用

食品工业科技编辑部

2024-10-14

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摘要

为了研究生姜多糖对高脂饮食（High-fatdiet，HFD）和小剂量链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）联合诱导的2型糖尿病（Type2 diabetes，T2D）小鼠肠道菌群的调节作用，南京农业大学食品科技学院汪妮，陈梦霞，孟凡强，周立邦，陆兆新等采用热水浸提乙醇沉淀的方法，从生姜中提取出多糖，通过单因素实验和正交试验优化提取条件，随后选择最佳的脱蛋白方法得到生姜多糖（Ginger polysaccharide，GP），并通过测定GP对2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二铵盐（2,2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）自由基和羟基自由基的清除能力，评价了其体外抗氧化能力。随后，通过高脂饮食和STZ建立2型糖尿病小鼠模型，测定各组小鼠的空腹血糖（Fasting blood glucose，FBG）浓度和糖化血清蛋白（Glycated serum protein，GSP）水平，采用16SrRNA高通量测序技术分析糖尿病小鼠的肠道菌群组成。结果表明，GP最优提取工艺为料液比1:20 g/mL、提取温度90 ℃、提取时间1 h；采用Sevag试剂处理5次进行脱蛋白得到GP，得率为2.91%±0.25%，其中GP中总糖含量为43.44%±0.99%；当GP浓度达到4 mg/mL时，GP对ABTS^＋自由基和羟基自由基的清除率分别为66.09%和65.73%；在GP的干预下，显著降低了糖尿病小鼠FBG浓度和GSP水平（P<0.05），16S rRNA测序结果表明，GP改变了糖尿病小鼠的肠道菌群组成和相对丰度，增加了阿德勒克氏菌属（Adlercreutzia）、阿克曼菌属（Akkermansia）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）等有益菌的相对丰度，降低了普雷沃氏菌属（Prevotella）等有害菌的相对丰度。通过热水浸提法提取和Sevag脱蛋白所得生姜多糖能改变糖尿病小鼠肠道菌群的组成，该研究结果为生姜多糖预防和治疗T2D提供了理论依据。

糖尿病（Diebetes mellitus，DM）是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，由胰岛素作用缺陷、胰腺细胞胰岛素分泌缺陷或两者兼有引起。糖尿病患者的慢性高血糖可导致多种长期并发症，包括对神经、血管、眼睛、心脏和肾脏等多个器官的损害。当前，糖尿病已经成为危害人类健康仅次于癌症、心血管疾病的三位常见慢性病。肠道菌群对宿主的健康具有重要意义，具有防御病原体入侵、促进物质代谢、合成维生素和抗肿瘤等功能。肠道菌群的生物失调与2型糖尿病的发生关系密切。Larsen等研究显示，糖尿病与非糖尿病患者肠道菌群存在明显不同，其中糖尿病患者肠道中厚壁菌门相对丰度明显下降，变形菌门则高度富集。此外，常用于治疗2型糖尿病的口服药物二甲双胍，已被发现可以通过调节肠道微生物群来改善2型糖尿病患者的血糖。

2020年发布的《中国2型糖尿病防治指南》提出，饮食运动干预及服用二甲双胍对2型糖尿病患者血糖具有较好的控制作用，当饮食和运动无法有效地控制血糖时应及时给予口服降血糖药。现有常用降血糖药物主要包括噻唑烷二酮类、格列奈类、磺脲类和双胍类，大多数降血糖药物都有不良反应，如低血糖、体重增加或胃肠道不适。而从天然植物中提取的活性成分用于治疗糖尿病，具有作用功效温和持久、毒副作用较低，并可有效延缓并发症的发生和发展。

多糖作为天然药物中降血糖的活性成分之一，在经过肠道时起到益生的作用，一方面作为益生菌生长的碳源，另一方面通过益生菌作用于多糖所产生的代谢产物来对肠道菌群进行调控。生姜（Zingiber officinale Rosc.）是一种药食两用的植物，在食品和医药领域有着广泛的应用，古人常以生姜为原料制作姜茶，用于驱寒和治疗风寒等，生姜在现代主要用于缓解孕妇的恶心和呕吐，且在2型糖尿病、高脂血症、超重和肥胖症等的临床应用中具有抗炎和代谢等作用。生姜多糖是生姜中的重要组成成分，含量约为5.97%，具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、抗凝血和降血糖等多种生物活性。目前国内外关于生姜多糖对糖尿病患者肠道菌群是否具有调节作用尚未研究。本文研究生姜多糖的提取工艺及其对糖尿病小鼠肠道菌群的调节作用，为糖尿病的预防和治疗提供了理论依据。

结果与分析

2.1　生姜多糖提取工艺的单因素实验

2.1.1 料液比对生姜多糖得率的影响　

由图1可知，当料液比从1:10到1:20 g/mL的过程中，多糖得率增加，并在1:20 g/mL达到最大值，当料液比从1:20到1:50 g/mL的过程中，多糖得率逐渐减小，出现这种现象的原因可能是随着溶剂比例的增加，生姜内部组织细胞和外部溶剂之间的浓度差增加，使多糖快速扩散和溶解，多糖溶出量增加，当溶剂超过一定比例后，多糖溶出量减少，可能是由于过多的溶剂会造成细胞破裂时的阻力增加，从而降低多糖的溶出。因此选择料液比1:20 g/mL用于后续实验。

图1 料液比对生姜多糖得率的影响

Fig.1 Effect of ratio of material to water on the yield of GP

注：对于同一指标不同的字母表示在统计学上具有显著性差异（P<0.05）；图2~图6同。

2.1.2 提取温度对生姜多糖得率的影响　

由图2可知，随着提取温度的升高，多糖得率也随之增加，当温度高于90 ℃时，多糖得率增加变缓，且与100 ℃时多糖的得率无显著性差异，其原因可能由于温度升高，分子运动速度变快，导致多糖在溶剂中扩散、溶解速度加快，使多糖更容易从细胞内转移到溶剂中，因此多糖得率增加；当温度高于90 ℃时，长时间过高的温度一方面会造成生姜中其他物质扩散到溶剂中，导致溶剂对多糖的溶解度达到饱和，另一方面可能会导致部分多糖发生降解，从而使多糖得率增加变缓。为了节约能源和避免高温对多糖结构的破坏等，因此选择提取温度90 ℃用于后续实验。

图2 提取温度对生姜多糖得率的影响

Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of GP

2.1.3 提取时间对生姜多糖得率的影响　

由图3可知，随着提取时间的延长，多糖得率先增加后减少，并在提取时间为1.5 h达到最大值，但各组之间差异不显著。原因可能是提取时间的延长会导致生姜多糖在溶剂中扩散和溶解达到平衡，并且长时间提取会造成生姜中其他物质的溶出，从而导致多糖得率下降。继续增加提取时间只会增加成本和延长提取周期，因此选择提取时间为1 h用于后续实验。

图 3 提取时间对生姜多糖得率的影响

Fig.3 Effect of extract time on the yield of GP

2.2　生姜多糖提取的正交试验

根据单因素实验结果，确定了生姜多糖提取的料液比、温度和时间3个因素的3个水平，并采用L9（3⁴）正交表进行实验。通过表 2的极差分析可得，三个因素对生姜多糖得率的影响顺序为：提取温度>料液比>提取时间，同时可得生姜多糖提取的最优组合为 A2B3C1，即料液比1:20 g/mL、温度100 ℃、时间1 h，此时生姜多糖得率为15.37%±0.66%；通过表3的方差分析可得，料液比和提取温度对于生姜多糖得率均有显著性差异（P<0.05），而提取时间对于生姜多糖得率没有显著性差异。考虑到提取温度过高会造成成本和能耗的增加以及多糖的降解，将正交试验结果各因素经过多重比较后，结果如表4所示，最优组合应为A2B2C1，即料液比1:20 g/mL，提取温度90 ℃，时间1 h。在该条件下进行实验，生姜粗多糖得率为16.25%±3.89%。

表 2 正交试验结果

Table 2 Results of orthogonal experimental design

表 3 正交试验结果方差分析

Table 3 ANOVA of orthogonal experimental design results

表 4 正交试验结果多重比较（Tukey 法）

Table 4 Multiple comparisons of orthogonal experimental design results (Tukey)

注：不同的字母表示在统计学上具有显著性差异（P<0.05）。

2.3　生姜多糖脱蛋白

2.3.1 大孔吸附树脂法　

由图4可知，使用S-8树脂处理后，生姜多糖中多糖含量高，为15.33%，多糖损失率为18.44%，蛋白含量为5.08%，蛋白脱除率为32.21%；使用NKA-9树脂处理后，生姜多糖中蛋白含量最低，为2.06%，蛋白脱除率为72.51%，多糖含量为7.78%，多糖损失率为58.63%。以上结果表明，NKA-9树脂具有较强的脱除生姜多糖溶液中蛋白的能力，但是同时也会造成多糖的大量损失。

图 4 不同类型的大孔树脂对生姜多糖吸附性能的比较

Fig.4 Comparison of adsorption properties of different types of macroporous absorbent resins on GP

2.3.2 Sevag 法　

由图5可知，随着Sevag试剂处理次数的增加，生姜多糖中蛋白质的含量逐渐减少，处理次数达到5次时，蛋白含量为2.59%，蛋白脱除率为60.15%，同时生姜多糖中多糖含量逐渐减少，多糖含量为15.96%，多糖损失率为7.93%。结果表明，Sevag试剂在沉淀蛋白质的同时，也会吸附一定量的多糖，造成多糖的损失。综合考量生姜多糖脱蛋白后的多糖损失率和蛋白脱除率，最终采用Sevag法脱蛋白。经Sevag法脱蛋白后，生姜多糖的得率为 2.91%±0.25%，并测得其中总糖含量为43.44%±0.99%。

图 5 Sevag 法分次脱蛋白结果

Fig.5 Results of fractional deproteinization by Sevag method

2.4　生姜多糖的抗氧化活性

由图6可知，当生姜多糖浓度在0.25~4 mg/mL的范围内，其对ABTS⁺自由基和羟基自由基的清除能力随着浓度的增加而增强。生姜多糖和V_C清除ABTS⁺自由基的IC₅₀值分别为1.92和0.053 mg/mL。生姜多糖清除羟基自由基的IC₅₀值为2.08 mg/mL，V_C为0.54 mg/mL。在之前的研究中，当夏枯草多糖PV-P1为4 mg/mL时，对ABTS⁺自由基的清除率为30.3%，而相同浓度下，生姜多糖对ABTS⁺自由基的清除率明显高于PV-P1为66.09%。以上结果表明生姜多糖对ABTS⁺自由基和羟基自由基具有较强的清除活性。

图 6 生姜多糖对 ABTS⁺自由基和羟基自由基的清除活性

Fig.6 Scavenging activity of GP on ABTS⁺ radical and hydroxyl radical

2.5　生姜多糖对糖尿病小鼠血糖的调节作用

糖尿病治疗的关键在于能有效地控制血糖，而糖化血清蛋白水平能反映出机体过1~3 周血糖的平均水平。由表5可知，当实验进行到第9周时，生姜多糖组小鼠的FBG浓度和GSP水平均与模型组小鼠小鼠存在显著性差异（P<0.05），而与正常组小鼠无显著性差异。实验结果表明生姜多糖能够有效地降低糖尿病小鼠的血糖，使其达到正常水平。

表 5 不同组中小鼠空腹血糖和糖化血清蛋白水平

Table 5 Fasting blood glucose and glycated serum protein levels of mice in different groups

注：NC 正常组，MOD 模型组，GP 生姜多糖组；FBG 空腹血糖，GSP 糖化血清蛋白；不同的字母表示在统计学上具有显著性差异（P<0.05）。

2.6　糖尿病小鼠属水平上肠道微生物组成分析

由图7可知，在属水平上，各处理组的肠道微生物主要包括：颤螺菌属（Oscillospira）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、阿德勒克氏菌属（Adlercreutzia）、阿克曼菌（Akkermansia）、幽门螺杆菌属（Helicobacter）、拟杆菌属（Bacteroides）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、普雷沃氏菌属（Prevotella）和别样棒菌属（Allobaculum）。与模型组相比，在生姜多糖组中丰度增加的肠道菌群有：颤螺菌属（Oscillospira）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、阿德勒克氏菌属（Adlercreutzia）、阿克曼菌属（Akkermansia）、幽门螺杆菌属（Helicobacter）和乳酸杆菌属（Lactobacillus），丰度降低的肠道菌群有：拟杆菌属（Bacteroides）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、普雷沃氏菌属（Prevotella）和别样棒菌属（Allobaculum）。表明生姜多糖能改变糖尿病小鼠中肠道菌群的组成。

图 7 属水平上肠道微生物组成

Fig.7 Gut microbial composition at the genus level

讨论与结论

多糖的提取是其研究和应用的基础，成熟的提取技术对多糖的纯度至关重要，从而影响后续结构和活性的研究。热水浸提法是多糖提取的传统方法，本研究经过单因素实验和正交试验得到最优提取条件为料液1:20 mg/mL，提取温度90 ℃，时间 1 h。在该条件下进行实验，多糖得率为16.25%，与之前的研究相比，显著提高了生姜多糖的得率。

本研究采用Sevag法去除生姜多糖中的蛋白质，将蛋白含量6.49%减少至2.59%，而多糖损失率仅为7.93%。随后，通过测定生姜多糖对ABTS⁺自由基和羟基自由基的清除能力，证明生姜多糖具有较强的抗氧化能力，表明生姜多糖具有应用于食品和药品等领域的潜力。

肠道菌群是人体内最复杂和种群数量最多的微生物聚集地，在正常人体的肠道内存在的主要肠道菌属有：拟杆菌属、双歧杆菌属、真杆菌属、梭菌属、消化球菌属、消化链球菌属和瘤胃球菌属。肠道菌群失衡与许多疾病的发生密切相关。

本研究中，生姜多糖有效地降低了小鼠的血糖水平，并增加了有益菌颤螺菌属（Oscillospira）、阿德勒克氏菌属（Adlercreutzia）、阿克曼菌属（Akkermansia）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）的丰度，降低了有害菌普雷沃氏菌属（Prevotella）的丰度。其中颤螺菌属（Oscillospira）与肥胖有关，且与抑制肥胖的菌株小克里斯滕森氏菌（Christensenella minuta）高度正相关，此外，高动物脂肪饮食会造成颤螺菌属（Oscillospira）的丰度大大增加；阿德勒克氏菌属（Adlercreutzia）是一种能产生短链脂肪酸并具有抗炎作用的细菌；阿克曼菌属（Akkermansia）是一种黏蛋白降解菌，定植于肠道的黏膜层，能增强肠道屏障功能，与多种疾病呈负相关，如炎症性肠病（IBD）、肥胖和糖尿病等；普雷沃氏菌属（Prevotella）被证实会诱导胰岛素抵抗，此外，在伴随有高血压的糖尿病以及伴随有高血压和高血脂的糖尿病中，普雷沃氏菌属（Prevotella）的丰度增加。

综上，经热水浸提法提取和 Sevag法脱蛋白所得的生姜多糖能改变糖尿病小鼠肠道内肠道菌群的组成，增加相关有益菌的丰度，发挥降血糖的作用。

引用本文：汪妮，陈梦霞，孟凡强，等. 生姜多糖的提取及其对糖尿病小鼠肠道菌群的调节作用[J]. 食品工业科技，2023，44（4）：278−286. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022060155.

Citation: WANG Ni, CHEN Mengxia, MENG Fanqiang, et al. Extraction of Polysaccharide from Zingiber officinale Roscoe and Its Regulatory Effect on Intestinal Flora in Diabetic Mice[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(4): 278−286. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022060155.

基金项目: 国家自然科学基金项目（32072182）。

通信作者简介

陆兆新，男，南京农业大学教授（钟山学者首席教授）、博士生导师。1995年3月获日本近畿大学博士学位；1997年9月南京农业大学食品科技学院教授，历任食品科学系主任、副院长、院长、食品与工程学部主任，现任南京农业大学食品生物技术研究所所长。主要从事食品微生物、食品生物技术和酶在农产品加工中的应用基础研究。主持国家自然科学基金、国家科技部“十五”重大科技项目、“863”高技术重点项目和科技部“农业支撑项目”等研究项目三十余项。研究成果分别获1998年度教育部科技进步二等奖和1999年度农业部科技进步二等奖和2006年度中国高校科技进步二等奖；获发明国家专利70余项，主编教材、专著4部。在国内外主要刊物上发表论文400多篇，其中SCI论文250余篇，H指数47（google scholar），引用8000余次。主持国家精品课程“食品微生物学”，主持教改项目获江苏省高等教育优秀教学成果一等奖和二等奖。2000年获国务院“政府特殊津贴”，2000年江苏省“333人才工程”第二层次培养对象，2007年江苏省“333人才工程中青年科技领军人才”，2008年获得“江苏省有突出贡献的中青年专家”。中国微生物学会理事、江苏省食品科技学会副理事长。曾任省政府参事、江苏省政协委员、常委，“九三”学社江苏省省委委员、常委和省直工委主任委员。

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