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摘要
目的：探索饮食中添加苦荞来源的类外泌体囊泡（TBDNs）对小鼠主要生理指标的影响。方法：24只C57BL/6小鼠随机分为两组：正常对照组与添加TBDNs组，分析体重、血液生化指标、小鼠结肠、肝脏细胞组织学与免疫组织化学，肠道菌群变化。结果：相对正常饮食组，10 mg TBDNs 剂量组小鼠体重、甘油三酯、尿酸、丙氨酸氨基转移酶显著下降（P<0.01）；天冬氨酸氨基转移酶 、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白以及肌酐等生理指标及肝脏、结肠组织等未见显著改变（P>0.05）；肠道中乳杆菌属Lactobacillus、苏黎世杆菌属Turicibacter和Lachnoclostridium均显著提高（P<0.05）。结论：TBDNs摄入对小鼠生理有一定影响，但其作用机制及对健康的意义仍需进一步探讨。研究结果为苦荞的营养评价提供了新的视角与资料。
苦荞麦F. tataricum属蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum）植物，是传统的食药兼用谷物，富含多种营养功能物质，如抗性淀粉、多酚、活性肽、多糖等。已有研究表明，苦荞具有降糖、降脂、降压和改善微循环等作用，常推荐用于降低三高的饮食健康管理谷物。然而，仅从传统营养活性成分角度解析苦荞营养作用机制尚存争议，例如，Stewart等报道1.2%槲皮素喂养8周不能改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗，与传统认为黄酮类成分是苦荞发挥降脂活性的营养物质认识不一致。因此苦荞中可能尚存其它“营养暗物质”发挥生理作用。
植物细胞向外分泌的类外泌体样纳米颗粒（exosome-like nanoparticles，ELNs），是具有纳米样结构的囊泡，含脂类、蛋白、miRNA等。目前，已有大量研究证明ELNs具有多种生理功能，如葡萄、生姜、橙子、蓝莓等的外泌体样纳米颗粒。研究发现，来自葡萄、胡萝卜和生姜的外泌体样纳米颗粒可介导小鼠肠道组织重塑和预防炎症性肠病，减轻肠道屏障损伤引起的免疫反应。蓝莓来源的外泌体样纳米颗粒（blueberry exosomes-like nanoparticles，BELNs），能改善高脂饮食（high-fat diet，HFD）喂养的小鼠非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD） 模型的胰岛素抵抗，并具有调节脂肪酸合成基因的表达以及 Nrf2 在肝脏的分布减轻肝脏的氧化应激反应等作用。越来越多证据表明植物来源的类外泌体样纳米颗粒（PELNs）参与人体生理活动并发挥相关功能。因此从PELNs层面揭示苦荞生物效应可为苦荞的质量评价提供新的观点。
课题组前期从苦荞中提取类外泌体，体外实验发现其能被肠道菌群吸收；生信分析与体外验证结果表明苦荞来源类外泌体囊泡（Tartary buckwheat-derived nanoparticles，TBDNs）可以调节鼠李糖乳杆菌、大肠杆菌的生长，这可能与TBDNs中含有的脂质、蛋白以及miRNA等非编码RNA有关，从TBDNs角度阐明苦荞饮食合理性具有重要意义。《本草纲目》记载苦荞“发风动气、能发诸病”，说明长期食用苦荞可能对健康产生不利影响。因此本文重点考察在正常饮食条件下TBDNs对C57BL/6小鼠生理指标的影响，为进一步揭示TBDNs对健康的影响提供资料，也为后续苦荞营养功能评价奠定基础。
结果与分析
2.1 TBDNs 对HFD 小鼠体重、进食量的影响
在本研究中，通过差速离心与PEG沉淀法结合从苦荞中分离出TBDNs样品，在透射电子显微镜下，能够观察到典型的茶托型囊泡结构，如图1A所示。提取的TBDNs经过粒径测试结果见图1B，其平均粒径为182.8 nm，粒径主峰在162.8 nm。本研究提取出的TBDNs与前期课题组采用超速离心法提取的TBDNs的表征相似。因此，可以说明本文成功从苦荞中优化提取出了TBDNs。
图 1 苦荞来源的纳米颗粒表征
Figure 1. Characterization of TBDNs
注：（A）苦荞来源的纳米颗粒电镜图（100000×）；（B）苦荞来源的纳米颗粒粒径分布。
相关研究报道，PELNs能够被动物的胃肠道吸收从而影响其生理状态。因此，首先考察了苦荞类外泌体囊泡（TBDNs）对小鼠生理的影响。PEG提取得到的TBDNs沉淀分离后称重，每100 g苦荞约可提取10 mg的TBDNs。根据《中国居民膳食指南（2022）》推荐，每天摄入全谷物及杂豆类50~150 g（干重）。因此，选用10 mg TBDNs进行灌胃。在本研究中，对C57BL/6小鼠进行10 mg TBDNs灌胃8 周后，TBDNs灌胃组（C_10）体重增长曲线低于正常饮食组（C）体重增长曲线（图2A）；TBDNs灌胃组（C_10）小鼠体重为25 g左右，与正常饮食喂养组小鼠相比，体重显著降低（P<0.001）。进一步统计所有小鼠的摄食量发现（图2B），TBDNs灌胃组（C_10）的日均摄食量略低于正常组（C）小鼠。这些结果表明，TBDNs可能会通过影响食欲来影响正常饮食小鼠的体重。但TBDNs影响小鼠体重的原因和途径需进一步分析。
图 2 TBDNs 喂养对小鼠体重以及日均摄食量的影响
Figure 2. Effects of feeding TBDNs on the body weight and daily food intake of mice
注：（A）不同处理组小鼠体重增长曲线；（B）不同处理组小鼠日均摄食量差异；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；ns P>0.05；图3、图4、图7、图9同。
图 3 TBDNs 对小鼠肝功能、肾功能的影响
Figure 3. Effects of TBDNs on liver function and kidney function in mice
虽然TBDNs降低了ALT、TG和UA的水平，但这些指标并未低于正常值。这种适度的调节作用可能暗示了TBDNs在维持生理平衡方面的潜在益处。然而，这些生理指标变化的健康意义还需要进一步分析。与BELNs不同，本文的研究发现TBDNs对天冬氨酸氨基转移酶（AST）、胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）以及肌酐（CREA）水平均没有显著影响（P>0.05）（图3B、D、E、F、G ）。这种差异可能源于类外泌体的来源、提取方法以及实验动物模型的不同。基于本研究结果，认为在正常情况下摄入TBDNs对血液生化指标的影响相对较小。为了更全面地了解TBDNs的生理效应，未来的研究可以考虑增加TBDNs的浓度，或者在不同的生理和病理模型中进行观察。这不仅有助于深入了解TBDNs的作用机制，还可能为开发基于植物类外泌体的新型功能性食品或治疗策略提供重要依据。
《本草纲目》记载苦荞“发风动气、能发诸病”，其机理尚无合理解析。由于对TBNDs的功能认识尚不足，本文首先考虑在正常条件下摄入TBDNs对小鼠传统生理指标、肝脏以及结肠组织等的影响。HE染色结果表明，两组肠道上皮细胞的炎性细胞浸润以及肝组织切片均无显著变化（图4A、B）。油红O染色（图4C）和脂滴面积定量分析（图4D）同样显示无显著性变化（P>0.05）。进一步通过评估正常组和TBDNs组对小鼠结肠屏障功能的影响（图5），发现与正常组相比，TBDNs组的肠上皮Occludin和ZO-1的表达也未发生显著改变。对肝组织免疫组化检测，评估正常组和TBDNs组对小鼠抗原抗体的反应（图6）。与正常组相比，TBDNs组的CD4、F480、MPO的表达未发生显著变化。这些结果表明正常饮食下添加TBDNs对肝脏炎症、脂肪积累、肠道屏障功能等无不良影响。
图 4 TBDNs 对小鼠肝脏、结肠的影响
Figure 4. Effects of TBDNs on liver and colon in mice
注：（A）结肠HE染色（200×）；（B）肝脏HE染色（200×）；（C）肝脏油红O染色（200×）；（D）肝脂质面积。
图 5 TBDNs 对小鼠结肠组织中屏障相关蛋白的影响（200×）
Figure 5. Effect of TBDNs on barrier-associated proteins in mouse colon tissue (200×)
图 6 小鼠肝脏组织中CD4+、MPO+和F4/80+细胞的免疫组织化学染色（9×）
Figure 6. Representative liver sections stained with antibodies to CD4+, myeloperoxidase+ (MPO+) and F4/80+ (9×)
本研究扩增 16S rRNA 获得粪便微生态中的细菌群落结构。本实验中所测得的样本共获得428661条序列。通过比对过滤后，共得到325437条有效的序列用于后续的分析。对粪便微生态α多样性的分析，可以看出，正常组与TBDNs组对应的 Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数以及PD指数均无显著性差异（P>0.05）（图7），表明TBDNs的摄入不会对正常小鼠肠道微生态造成紊乱，仍能维持良好的肠道稳态。
图 7 α多样性指数
Figure 7. Alpha diversity index
同时，从图8也可以看出，TBDNs组与正常组样本间共有的OUT数目占比高达99.65%（图8A），TBDNs处理组样本间特有的OUT数目共有93种。对不同处理间的β多样性分析结果如图8C，本实验基于主坐标 PCoA 分析表明，正常组的肠道微生物群落与TBDNs处理组虽然没有达到显著差异，但也可以看出其分布的不同，这可能受动物个体差异的影响较大。在属水平上可以看出，正常组与TBDNs组的肠道微生物群落组成比例有一定差异（图8B）。正常组的优势菌群有乳杆菌属Lactobacillus、瘤胃球菌属Ruminococcus、拟杆菌Bacteroides、苏黎世杆菌属Turicibacter和蓝绿藻菌属Lachnoclostridium。
图 8 TBDNs对小鼠肠道菌群的影响
Figure 8. Effect of TBDNs on intestinal microbiota in mice
注：（A）Venn 图；（B）属水平上的物种组成；（C）PcoA 图。
相比正常组，TBDNs组的乳杆菌属Lactobacillus、苏黎世杆菌属Turicibacter和蓝绿藻菌属Lachnoclostridium的相对丰度显著增加（P<0.05）（图9）。研究表明，Lactobacillus是一种益生菌，对人体健康有着重要的作用，具有抑制有害菌的生长，维护肠道菌群平衡，防止肠道感染和炎症的作用。Lachnoclostridium与多种代谢性疾病的发生密切相关，包括肥胖、高血压、糖尿病等，其相对丰度与血糖水平呈负相关。Lachnoclostridium是一种能够利用单糖和双糖产生乙酸的细菌，而乙酸可以通过抗炎和免疫抑制作用有效地稳定肠道内环境。此外，乙酸还可以作为细菌的ATP产生的氧化产物，Lachnoclostridium的丰度与肠道内乙酸水平呈正相关，而且Lachnoclostridium还能够通过代谢L-谷氨酸来产生乙酸等短链脂肪酸，这些短链脂肪酸对于肾脏保护具有重要作用，如抗炎、抗动脉粥样硬化和抗氧化等。因此，这些有益菌的增加具有潜在的健康效益。
图 9 TBDNs对小鼠肠道菌群影响的物种丰度比较
Figure 9. Comparison of species abundance of TBDNs on the gut microbiota of mice
本文的研究结果显示，TBDNs组中的瘤胃球菌属Ruminococcus的相对丰度显著降低（P<0.05）。研究发现，活跃期炎症性肠病（IBD）通常伴随着瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）的增加。由于炎症促进黏膜氧化应激，这可能会形成土著微生物群落，有利于兼性厌氧菌的生长，如Ruminococcus gnavus，它被认为是IBD中改变的微生物群的重要菌群。此外，R. gnavus还与其他免疫相关疾病如儿童哮喘、婴儿湿疹、脊柱关节炎、系统性红斑狼疮、超重肥胖和一些代谢疾病（II型糖尿病、非酒精性脂肪肝等）有关，大部分研究认为，瘤胃球菌属与II型糖尿病呈正相关，但也有小部分研究结果不一致。研究表明，在减肥手术和糖尿病缓解后，Ruminococcus bromii、Ruminococcus obeum丰度增加，而Ruminococcus torques丰度降低。这些现象可能是由于瘤胃球菌偏好植物中的多糖，如果肠道中有过多的瘤胃球菌，细胞会吸收更多的糖，不可避免地导致体重增加。因此，肠道中瘤胃球菌属的丰度会受到饮食的影响，但饮食的作用似乎很复杂，该复杂作用可能源于瘤胃球菌属的复杂构成。瘤胃球菌属包括有益菌和有害菌。例如，已知Ruminococcus bromii对健康具有有益效果。当长期食用水果和蔬菜时，瘤胃球菌属能够发酵复合糖类，产生乙酸酯、丙酸盐以及具有抗炎效益的丁酸盐。而肉食会增加有害菌 Ruminococcus gnavus，部分瘤胃球菌属已被证明具有促炎性，除了肉食之外，高盐饮食、大豆、抗性淀粉也会增加瘤胃球菌的丰度。
灌胃TBDNs也显著降低了拟杆菌属Bacteroides的丰度（P<0.05）。不同拟杆菌种类与不同炎症性肠病程度相关，炎症性肠病患者粪便微生物分析显示，拟杆菌门、厚壁菌门和疣微菌门的丰度下降，而变形菌门、放线菌门和梭杆菌门的丰度增加。在48名克罗恩病患者中，粪便样本中的拟杆菌细菌丰度不到健康个体的10%。然而，大多数研究表明，拟杆菌因内毒素而表现出促炎特性，并影响细胞因子的产生，从而导致炎症性肠病。总的来说，相对正常组，TBDNs的部分微生物发生了显著变化，但其对小鼠生理作用的影响是否存在因果关系仍需进一步验证、探明。
结论与展望
Citation: ZHANG Jiyue, REN Chaoqin, CAO Yanan, et al. A Preliminary Study on the Effects of Tartary Buckwheat-derived Nanoparticles on the Physiology of C57BL/6 Mice[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(11): 329−337. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024060055.
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（以上信息来自成都大学官网）
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