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入选中国科技期刊卓越行动计划
本文获国家重点研发计划(2023YFD2100405);湖北省重点研发计划项目(2023BBB048);中国农科院青创专项(Y2024QC22);湖北省自然科学基金创新群体项目(2023AFA042);国家现代农业产业技术体系(cars-14)。
摘要
为探究物理场耦合酶解处理对亚麻籽植物乳的影响,本研究首先使用了低温等离子体对纤维素酶进行处理以提高其酶活,并根据酶活变化确定了最佳处理时间,然后使用荧光光谱、紫外光谱、圆二色光谱分析(Circular Dichroism spactra,CDs)对酶结构进行分析,探索其酶活改变机制;其次,研究了低温等离子体(Cold Plasma,CP)或脉冲电场(Pulsed Electric Field,PEF)单物理场协同酶解处理对亚麻籽乳酚类物质溶出及黏度的影响,并根据实验结果确定了PEF最佳处理电压。最后,使用CP(处理时间15 s)、PEF(处理电压3.7 kV/cm)物理双场协同纤维素酶对亚麻籽乳进行处理,探究了物理双场耦合酶解(Cold Plasma and Pulsed Electric Field coupled Enzymatic treatment,CP-PEF-EN)对亚麻籽植物乳总酚含量与黏度的影响。结果表明:使用CP处理纤维素酶时,纤维素酶酶活呈现先升高(15 s,最高89%)后降低趋势,光谱结果显示CP产生的活性离子和酶分子发生了相互作用,使得酶的催化活性中心以及官能团改变,导致酶结构改变,其β-折叠含量先增加后下降。CP或PEF单场耦合酶解均可提高亚麻籽植物乳总酚含量(提升率分别为CP:44.44%、PEF:46.97%),且CP-PEF-EN处理效果更好,总酚含量达0.327 g/100 g(提升率为65.15%),黏度为77.47 mPa·s(降黏39.92%)。本研究表明CP-PEF-EN处理可显著提高亚麻籽植物乳的总酚溶出率并降低其黏度,为新型绿色植物乳加工技术提供了参考。
结果与分析
2.1 CP处理对纤维素酶的影响
2.1.1 不同时间下CP处理对纤维素酶活性的影响
不同CP处理时间下,酶溶液活性变化如图2所示。从图2可以看出,酶活性提高率随处理时间呈先提高后降低的趋势,在CP处理时间为15 s时,纤维素酶活性提升率最高,达到了89%。有文献报道了类似的结果,随着CP处理时间的改变,酶活性呈现出先增加后降低的趋势。CP处理使纤维素酶活性提高的原因可能是CP产生的活性离子和酶分子发生了相互作用,使得酶的催化活性中心以及官能团外露和增加。随着处理时间增加,酶活性发生下降的原因可能是CP产生的物理轰击影响了酶的二级结构以及分子聚集状态,使得酶的构象在一定程度上发生改变,其活性中心进一步暴露在极性环境中,导致活性位点被破坏并影响了酶和底物结合的能力,引起酶活性下降。
图 2 CP处理前后纤维素酶的酶活(A)及酶活提升率(B)的变化
Figure 2. Changes in enzyme activity (A) and enzyme activity increase rate (B) of cellulase before and after CP treatment
注:不同小写字母代表组间差异显著(P<0.05),图6~图8同。
根据上述酶活性的变化,本研究进一步探究了CP处理对纤维素酶结构的影响。纤维素酶中存在像色氨酸(Tryptophan,Trp)、酪氨酸(Tyrosine,Tyr)以及苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)这样的特定芳香氨基酸残基,这些残基大多分布于蛋白质的内部,并且与蛋白质的三级结构息息相关。使用一定波长的光照射后,这些基团会产生自发荧光,而当这些基团暴露在极性很强的环境中时会发生荧光猝灭现象。荧光分析结果显示经CP处理后,纤维素酶在300~450 nm处的荧光发射强度发生了变化,如图3所示,经CP处理15 s后,纤维素酶的荧光强度略有升高,其最大吸收波长(λmax)从342.4 nm移动到343 nm,λmax的红移预示着Trp、Tyr以及Phe所处的环境极性变高,表明氨基酸残基向着纤维素酶的表面移动,酶结构在一定程度上展开,其疏水活性中心被包埋的程度下降,这可能提高了酶与底物接触的概率,从而在一定程度上提高酶的活性。
图 3 CP处理前后纤维素酶的荧光发射光谱
Figure 3. Fluorescence emission spectra of cellulase before and after CP treatment
如图4所示,纤维素酶在280 nm处有较大的紫外吸收,其主要是由蛋白质肽链上的Trp、Tyr以及Phe等残基的芳香杂环发生π→π*跃迁所引起的。未经处理的纤维素酶在270~285 nm范围内的最大紫外吸收值为2.848,经CP处理15 s后,纤维素酶的最大吸收值增加为3.112,这可能表明CP处理使酶的构象发生改变,其内部芳香残基中疏水芳香环朝着酶表面移动,从而使吸光度增加,这种变化可能更有利于酶与底物的接触。当处理时间为30 s和60 s时,纤维素酶的紫外吸收值较15 s时出现了下降,产生这种现象的原因可能是长时间的CP处理引发了酶蛋白之间的聚集,导致紫外吸收强度发生下降,这一结果会阻碍酶活性位点和底物之间的接触,从而影响酶的催化效率。随着处理时间增加到90 s和120 s时,纤维素酶的吸收强度出现了上升,原因可能是CP处理进一步破坏了酶结构中的肽键,蛋白质折叠展开,使酰胺基进一步暴露出来,同时,CP处理产生的活性氧和活性氮会一定程度增加体系酸度,并攻击活性基团,从而破坏芳香氨基酸。
图 4 CP处理前后纤维素酶的紫外吸收光谱
Figure 4. Ultraviolet absorption spectra of cellulase before and after CP treatment
CDs可以被用来分析蛋白质二级结构(α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲)及其变化。在本研究中使用CDs分析了不同CP处理时间对纤维素酶二级结构的影响。如图5A所示,未经处理的纤维素酶在210 nm和215 nm附近处出现了两个极小值,这被认为是具有“α+β”结构的特征吸收峰,该结果与Cui等的研究结果类似。经CP处理15 s后,纤维素酶的椭圆度(θ值)减小,表明CP处理改变了纤维素酶的二级结构,图5B所示的二级结构含量变化也证明了这个结果,经CP处理15 s后,纤维素酶的无规则卷曲含量减少,α-螺旋含量没有明显变化,处理前后分别为41.6%和41.1%,β-折叠含量从11.4%增加到15.5%。上述实验现象表明CP处理15 s后,纤维素酶的二级结构含量发生变化,纤维素酶构象改变,这一结果可能会在一定程度上改变酶的催化活性。结合荧光光谱分析的结果,β-折叠结构含量的变化表明纤维素酶结构展开,其催化活性中心朝着极性更强的环境移动,这将有利于酶与底物的接触,从而提高酶的催化活性。Chen等报道了使用3 kV低压等离子体处理糙米10 min后,其中的α-淀粉酶活性与对照组相比提高了62%。Lee等的研究也证明了类似的结果。
图 5 CP处理前后纤维素酶的圆二色性光谱(A)和二级结构相对含量(B)
Figure 5. Circular dichroism spectrum (A) and secondary structure relative content (B) of cellulase before and after CP treatment
随着处理时间的增加,纤维素酶的负椭圆度出现了减小(90 s除外),这可能是由于长时间的CP处理破坏了纤维素酶中的氢键,改变了α-螺旋结构,导致纤维素酶构象发生变化。当处理时间为90 s和120 s时,与未处理纤维素酶相比CP处理后α-螺旋的含量发生下降,分别从41.6%下降至35.8%和35.5%,这一结果与Attri等的研究类似。发生变化的原因可能是CP处理产生的活性物质诱导了α-螺旋中氢键断裂,从而破坏了α-螺旋结构,导致纤维素酶疏水活性中心直接暴露在极性环境中而失去活性。Guo等的研究表明,在50 kV电压下,使用CP处理胃蛋白酶以及α-凝乳胰蛋白酶会导致其构象发生显著变化,引起α-螺旋结构的减少以及无序结构的增加,无序结构增加的原因可能是在长时间的CP处理下,CP处理使得酶构象进一步改变,酶结构发生一定程度的解构,结构中β-折叠和α-螺旋向无规则卷曲转变,与本研究在CP处理120 s后的结果相符合。以上的结果表明,CP处理时间是其影响酶结构和活性的关键因素,短时间的CP处理可能会促进酶结构的展开,增加活性中心和底物接触的概率,提高酶催化效率。另一方面,长时间的CP处理会导致酶构象改变,引起活性中心所处极性环境的变化,使得活性位点失活,酶活性下降。这种差异的产生可能与CP处理产生的活性物质和酶的相互作用程度有关。
2.2 单物理场及其耦合酶解处理对亚麻籽植物乳黏度和酚类物质溶出的影响
2.2.1 CP-EN处理对亚麻籽植物乳黏度和酚类物质溶出的影响
根据上述实验的结果,选择CP处理15 s后的酶溶液对亚麻籽乳进行酶解处理,处理后亚麻籽乳中总酚含量以及黏度变化分别如图6A、B所示。从图中可以看出,与空白对照组及EN组亚麻籽乳相比,CP-EN亚麻籽乳具有更高的总酚含量(0.286 g/100 g)以及更低的黏度(83.81 mPa·s),从图6B中可以看出,CP-EN处理组黏度下降率显著高于EN组(P<0.05),进一步表明了CP处理可显著提高亚麻籽植物乳酶解效率。一项关于使用不同酶提取葡萄渣中酚类物质的研究表明,酶解后葡萄渣中的总酚含量提高了11%,其原因是纤维素酶降解了植物细胞壁,加速了酚类物质的溶出。经CP处理15 s后酶活性得到提高,与EN处理的亚麻籽乳相比能进一步加速植物细胞壁的水解,促进多酚类物质的溶出,使得CP亚麻籽乳总酚含量高于EN处理的亚麻籽乳。由于纤维素酶对多糖链之间的1,4-β-d-糖苷键的切割作用,可使得亚麻籽胶中的一些多糖分子发生断裂,减小其分子量,导致较弱网络结构的形成,从而进一步促进亚麻籽植物乳黏度下降,增强流动性。
图 6 CP-EN处理对亚麻籽乳的总酚含量(A)和黏度(B)的影响
Figure 6. Effect of CP-EN treatment on total phenolic content (A) and viscosity (B) of flaxseed plant-based milk
2.2.2 PEF处理对亚麻籽酚类物质溶出的影响
2.2.2.1 PEF处理对亚麻籽植物乳酚类物质溶出的影响
图7A显示了不同脉冲电场强度对亚麻籽乳中总酚类物质含量的影响,结果显示PEF处理后亚麻籽乳中总酚含量呈先减少后上升的趋势。当电场强度为3.7 kV/cm时,亚麻籽乳中总酚含量最高,为0.247 g/100 g。这与Zderic等的研究结果相符合,在低电场强度处理下多酚含量下降的原因可能是脉冲电场破坏了原有体系中多酚类物质的结构,并在一定程度上使部分多酚降解失活,随着电场强度的增加,亚麻籽乳中多酚提取总量增加,原因是PEF处理加快了亚麻籽细胞向周围溶剂中释放多酚的速度。由于本文所用PEF频率较大,实验发现高于3.7 kV/cm电压的PEF处理会使亚麻籽乳温度升高从而破坏植物乳风味,因此没有继续加大电压进行研究。
图 7 PEF(A)及PEF-EN(B)处理对亚麻籽乳总酚含量的影响
Figure 7. Effect of PEF (A) and PEF-EN (B) treatment on total phenol content of flaxseed plant-based milk
2.2.2.2 PEF-EN处理对亚麻籽植物乳酚类物质溶出的影响
如图7B所示,与空白对照组相比,较高电场强度PEF-EN处理的样品具有更高的多酚溶出量,当电场强度为3.7 kV/cm时,PEF-EN亚麻籽乳中总酚含量最高,为0.291 g/100 g。PEF具有典型的细胞结构破坏效应,同时也有文献报道PEF处理可显著减小植物乳粒径并降低沉淀量,因此在酶解亚麻籽植物乳之前,将酶解底物亚麻籽乳进行PEF处理可能会使得亚麻籽植物乳中植物碎片组织进一步裂解,形成更多酶解位点,使得酶解效率提升,多酚更多溶解在植物乳连续相中。
2.3 CP-PEF-EN处理对亚麻籽植物乳酚类物质溶出和黏度的影响
根据上述实验的结果,当脉冲电场强度为3.7 kV/cm时,亚麻籽乳中总酚含量最高;当低温等离子体处理时间为15 s时,所得到的纤维素酶活性最高。因此,选择在这两个条件下进行CP-PEF-EN处理实验,其总酚含量和黏度结果如图8A、B所示。从图8A可以看出,经CP-PEF-EN处理后亚麻籽乳总酚含量达0.327 g/100 g,与空白对照组、PEF组、PEF-EN组相比,分别提高了65.15%、36.82%和12.37%,与图6中EN组、CP-EN组相比分别提高了46.64%和14.34%,CP-PEF-EN处理对亚麻籽乳品质的改善效率优于单种因素处理;表明CP-PEF-EN既提高了酶催化活性,又加速传质,破坏细胞壁网络结构促进纤维素酶进一步与多糖分子接触反应,进一步降解细胞壁,促进多酚物质溶出,表明低耗物理双场实现了耦合增效。
图 8 不同处理方式下亚麻籽乳总酚含量(A)和黏度(B)对比
Figure 8. Comparison of total phenolic content (A) and viscosity (B) of flaxseed plant-based milk under different treatments
本文研究表明,在CP处理15 s条件下纤维素酶活性提高了89%,多谱学综合分析证明CP处理导致纤维素酶构象发生改变,增加其与底物的接触,提高酶解效率。当CP处理15 s时,CP-EN亚麻籽乳中的总酚含量达到0.286 g/100 g,较对照组提高44.44%;当脉冲电场强度为3.7 kV/cm时, PEF-EN亚麻籽乳中的总酚含量达到0.291 g/100 g,较对照组提高46.97%。两种物理场耦合处理的结果表明与单个物理场处理相比,两种物理场耦合能够更好地改善亚麻籽乳黏度和酚类物质溶出,CP-PEF-EN亚麻籽乳总酚含量为0.327 g/100 g, 比对照组提高65.15%;黏度为77.47 mPa·s,比对照组降低39.92%。综上所述,耦合物理场协同酶解处理可以作为一种新的改善植物乳黏度和酚类物质溶出的方法。然而,低温等离子体和脉冲电场处理在工业生产中的应用存在局限性,后续扩大规模如中试等研究仍有待开展。
Citation: TAN Xiao, HAO Qian, DENG Qianchun, et al. Effect of Physical Dual-field Coupled Enzymolysis on Phenolics Solubilization and Viscosity of Flaxseed Plant-based Milk[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(19): 85−94. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024090312.
通信作者简介
陈亚淑,中国农业科学院油料作物研究所油料品质化学与加工利用创新团队特聘研究员,主要从事特色油料全值化加工研究工作,揭示了亚麻籽胶、植物蛋白、多酚等稳定剂、乳化剂、抗氧化剂界面物理垒与自由基原位捕获/猝灭机理,实现了ω-3长链多不饱和脂肪酸、类胡萝卜素等特征营养组分的高效、稳定递送;主体参与建立了干法脱胶增溶,微波高效脱毒生香,梯度酶解进一步促溶、改善风味、提高组分生物利用度等关键技术并在多家企业实现转化应用,获批/申请发明专利15项,美国与加拿大专利各1项,参与立项/发布国家标准、农业行业标准、团体标准等11项,主持国家自然科学基金青年、面上、十四五重点研发计划子课题、湖北省重点研发计划等国家、省部级科研项目6项。
(以上信息来自作者本人、湖北工业大学官网)
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