为了提高双歧杆菌在生产和应用过程中的活性，本研究以长双歧杆菌长亚种为菌种，以膳食纤维作为载体制备了生物膜态双歧杆菌，分析了其在不同胁迫环境下的存活率以及对HT-29细胞和黏蛋白的体外黏附性，并通过体外发酵实验分析其对肠道微生物的影响。结果表明，生物膜态菌体细胞在过氧化氢处理60 min、65 ℃热处理30 min、冷冻干燥和模拟胃肠液处理后的存活率分别比浮游态组提高了2.91、2.10、1.69、5.67倍；生物膜态菌体细胞对HT-29细胞和黏蛋白的黏附能力相对浮游组提高了1倍以上。体外发酵结果显示，生物膜态菌体的加入可显著影响发酵体系的微生物组成；发酵24 h后，生物膜组发酵体系中双歧杆菌的相对丰度和绝对数量分别达到25.96%和1.81×109 CFU/mL，分别是浮游组的2.01倍和1.84倍；此外，短链脂肪酸的分析结果表明，生物膜组的乙酸、丙酸、丁酸含量显著（P<0.05）高于对照组和浮游组。这些结果表明，以膳食纤维为载体制备生物膜态长双歧杆菌可提高菌株的抗逆性、黏附性以及在肠道中的增殖能力。本研究可为高活性双歧杆菌制剂的开发和应用提供技术和数据参考。
作为最古老且有效的食品保鲜技术，低温贮藏在维持肌肉食品、水果和蔬菜的安全及质量方面发挥着关键作用，根据贮藏环境温度的不同，现代工业中通常以冷藏（0~4 ℃）和冷冻（低于−18 ℃）两种方式来提高产品的品质稳定性。近年来，与传统肉制品相比，调理牛排因其食用方便、营养均衡等优势，越来越受到消费者的青睐。调理牛排产品通常采用冷藏或者冷冻方式进行贮运销售。传统的冷藏技术货架期较短，难以进行长线的冷链运输；此外，尽管冷冻技术可以大幅度延长货架期，但是贮藏过程中冰晶的生长/再结晶会对肌肉组织造成剧烈的机械损伤，解冻后过多的汁液损失会直接损害行业的经济效益和消费者的健康需求。因此，有必要开发新型的低温保存技术以维持食品原有的品质。
以低纤维高脂肪为特点的西式饮食的流行，导致了肠道屏障损伤相关疾病发生频率的上升。近年来的研究证明，肠道微生物参与调控饮食造成的肠道屏障损伤。双歧杆菌作为肠道菌群的重要组成部分，对缓解饮食诱导的肠道菌群失衡、增强肠道屏障功能具有重要作用。双歧杆菌发挥其益生功能的前提是能够在肠道中有效定殖，但由于双歧杆菌特殊的生理特性，其在加工储藏过程中，极易受到外界温度、氧气、机械力等影响而失活，被摄入人体后还需要经受胃酸、胆盐等胃肠环境的胁迫，只有少数菌能到达肠道。目前很多双歧杆菌产品的活菌数和实际效果都难以达到预期。因此，如何提高双歧杆菌的自身抗性，提高其在胃肠道环境中的存活率和定植能力，成为双歧杆菌类益生菌产品在生产应用过程中的关键共性问题。
生物膜是自然界中微生物的主要存在形式，可以使细菌粘附于介质表面并分泌胞外聚合物将其包裹形成的聚集体。形成生物膜可以提高微生物细胞对外界条件的适应能力，帮助微生物更好地定植在特定环境中。早期关于肠道微生物生物膜的研究主要集中在病原菌领域，大量研究证明了生物膜的形成可以提高病原菌对肠道环境的抗性，增强病原菌的致病性和抗药性等。由于生物膜的特殊性质，近年来，益生菌生物膜的研究和应用逐渐受到关注。将益生菌以类生物膜的形式黏附在一定的基质中，可以提高菌株的耐酸、耐渗透压、抗冷冻干燥等能力，强化益生菌产品在生产和应用过程中的活性，同时使其在胃肠道环境中具有较高存活率，从而增强益生菌的生理功能。
非水溶性膳食纤维基质粒径小、表面粗糙、附着面积大，从成膜角度而言是双歧杆菌理想的分散固相界面成膜基质，具有大规模、高效制备生物膜的潜能。前期研究分析了长双歧杆菌长亚种在不同膳食纤维基质中的成膜特点，发现在以芒果皮膳食纤维为基质时，菌株具有较好的成膜能力。本研究将在此基础上，通过氧暴露、高温处理、冷冻干燥、模拟胃肠液体等外胁迫实验分析生物膜态双歧杆菌的抗逆性，并通过体外黏附实验和体外发酵实验分析其定植能力和对肠道微生物组成的影响，为开发高活性双歧杆菌产品提供方法和理论参考。
2.1 生物膜态长双歧杆菌的抗逆性
双歧杆菌属于专性厌氧微生物，在生产应用过程中氧气或其他强氧化物质容易对其造成氧化应激，导致菌体损伤和活性下降，限制了双歧杆菌的应用。本研究通过比较菌株在有氧和厌氧条件下培养的活菌数比值（RBGR 值），分析了生物膜组和浮游组长双歧杆菌的氧气耐受性（图 1A）。结果表明，有氧环境显著抑制了双歧杆菌的生长。有氧培养 6 h 后，生物膜组和浮游组的 RBGR 值均在 0.6 左右，即菌体细胞增值率为无氧条件的60% 左右，无显著差异（P>0.05）；培养 12 h 时，生物膜组的 RBGR 值显著高于浮游组（P<0.05）；培养24 h 时，两组的 RBGR 值均有一定下降，但生物膜组的 RBGR 值仍显著高于浮游组（P<0.05），分别为0.54 和 0.43。此外，过氧化氢处理后，生物膜组的存活率显著高于浮游组（P<0.05），处理 60 min 后两组存活率分别为 16.86% 和 5.80%（图 1B）。陆文伟等分析了 6 种生物膜态双歧杆菌的氧胁迫存活率，结果表明形成完整的生物膜可以显著提高菌株的氧耐受能力（P<0.05），且耐受特性存在种间差异。由于双歧杆菌生物膜具有一定的空间结构，外界物质进入生物膜必须通过物质运输通道，生物膜的空间位阻使氧气等物质形成浓度梯度，在提高了生物膜内部菌体的环境胁迫耐受性。
图 1 生物膜态和浮游态 BL-BOA-7 的氧耐受能力
Fig.1 Oxygen stress resistant ability of biofilm-type and planktonic BL-BOA-7
注：不同字母表示不同组间存在显著性差异（P<0.05），图 2~图 5、图 7 同。
2.1.2 热耐受能力
益生菌作为食品功能性原料，耐热性对于益生菌的应用具有重要的意义。本研究分析了生物膜态和浮游态长双歧杆菌在 45、55 和65 ℃ 条件下处理 30 min 后的存活率（图 2）。结果表明，45 ℃ 处理后，生物膜组和浮游组的存活率均为 64% 左右，没有显著差异（P>0.05）；但随着处理温度的升高，两组菌的存活率出现显著差异（P<0.05），其中 55 ℃ 时的存活率分别为 25.53% 和 19.46%，65 ℃ 时的存活率分别为 10.24% 和 4.87%。微生物形成生物膜时利用自身分泌的多糖、核酸等大分子物质将菌体进行包裹，这些胞外物质的存在可能为菌体在热应激下提供保护作用。而通过包埋处理可进一步提高益生菌的热耐受性。Shi 等以电纺纳米纤维毡为载体，制备了生物膜态植物乳杆菌，与浮游态菌体相比，生物膜态植物乳杆菌在 65 ℃ 处理后的存活率是浮游态的 2 倍，本研究结果与之相似。此外，抑制生物膜的形成可以降低细菌的热耐受能力。这些研究结果说明生物膜的形成与细菌的热耐受性有关。
图 2 生物膜态和浮游态 BL-BOA-7 的热耐受能力
Fig.2 Heat stress resistant ability of biofilm-type and planktonic BL-BOA-7
本研究以芒果皮膳食纤维为基质，制备生物膜态长双歧杆菌，发酵结束时，发酵体系中生物膜态菌体细胞的活菌数为 1.5×10^9 CFU/mL，占总活菌数的 40.6%。通过低速离心的方式将生物膜态菌体细胞进行分离，得到生物膜态长双歧杆菌，同时以浮游态长双歧杆菌作为对照，分别进行抗逆性试验，结果如图 3 所示。结果表明，冷冻干燥后，生物膜态和浮游态菌体的存活率分别为 41.82% 和24.78%（P<0.05），说明形成生物膜可以降低冻干过程对菌体细胞的损伤。E 等研究发现通过调节培养基中缓冲盐的组成，可以促进植物乳杆菌形成生物膜，并提高菌株的冻干存活率；而添加生物膜抑制剂，可以下调信号分子的表达、减少植物乳杆菌生物膜的形成，并降低菌株的冻干存活率。有研究表明，AI-2是促进生物膜形成的重要信号分子，冻干过程可以刺激乳酸菌 AI-2 的分泌，说明形成生物膜可能是乳酸菌抵抗冷冻胁迫的一种自我保活机制。
图 3 生物膜态和浮游态 BL-BOA-7 的冷冻干燥耐受能力
Fig.3 Freeze-drying stress resistant ability of biofilm-type and planktonic BL-BOA-7
2.1.4 胃肠液耐受性
双歧杆菌的主要定植在结肠中，在到达结肠之前，需要经过胃液和肠液刺激，因此能够耐受胃肠道环境的胁迫是其发挥功能的前提。在本研究中，生物膜组和浮游组双歧杆菌依次经过模拟胃液和肠液处理后，分析其存活率，结果如图 4 所示。胃液处理后，生物膜组的存活率显著高于浮游组（P<0.05），但两组存活率都在 50% 以上。经模拟肠液处理后两组存活率均明显下降，其中浮游组存活率的下降程度显著大于生物膜组，经模拟肠液处理 4 h 后，生物膜组的存活率为 8.96%，显著高于浮游组的 1.58%（P<0.05）。结果说明形成生物膜可以减少胃肠液对菌体细胞的损伤。陈翠翠等以小麦纤维和葡萄籽粉为载体制备了生物膜态双歧杆菌，发现其经过胃肠液连续处理后的存活率分别达到13.53% 和 10.75%，显著高于浮游态菌株（P<0.05），本研究结果与之相似。生物膜结构中的多糖等大分子物质可以阻碍菌体细胞与酸和胆盐的接触；此外，胆盐可促进双歧杆菌生物膜的形成，从而进一步提高其在胃肠道环境中的存活率。
图 4 生物膜态和浮游态 BL-BOA-7 的胃肠液耐受能力
Fig.4 Simulated gastrointestinal juice stress resistant ability
of biofilm-type and planktonic BL-BOA-7
2.2 生物膜态长双歧杆菌的体外黏附性
益生菌在肠道中定植的第一步是在肠上皮进行黏附，随后进行增殖。因此，对肠上皮细胞的黏附性能力是评价益生菌的重要指标。本研究利用 HT-29 细胞和黏蛋白，分析了生物膜态长双歧杆菌的黏附性（图 5）。结果表明，生物膜组对 HT-29 细胞和黏蛋白的黏附性均显著高于浮游组（P<0.05）。生物膜结构主要由菌体分泌胞外多糖（EPS）、蛋白质和胞外核酸（eDNA）等物质所产生的具有黏附能力的基质相互粘附，同时使菌体结构层层积累所形成。构成生物膜的这些胞外物质与肠道表面的黏蛋白之间的相互作用对于菌体的黏附能力具有重要影响。细菌胞外多糖可被肠上皮细胞表面的受体识别和结合，从而影响细菌宿主细胞之间的相互作用，增强双歧杆菌对肠上皮细胞的黏附性。但也有研究得到相反的结果，即胞外多糖抑制菌体对肠上皮细胞的黏附，说明胞外多糖的分子量、单糖组成会影响细菌与肠上皮细胞的相互作用，因此需要进一步的深入研究。
图 5 生物膜态和浮游态 BL-BOA-7 的体外黏附能力
Fig.5 In vitro adhesion ability of biofilm-type and planktonic
BL-BOA-7
2.3 生物膜态长双歧杆菌对肠道菌群的影响
2.3.1 生物膜态长双歧杆菌对肠道微生物组成的影响
正常情况下，宿主的肠道菌群的组成相对稳定，益生菌相对于这个稳定的微生态系统而言，属于外来菌株，因此进入宿主肠道后可能与土著微生物之间存在一定的竞争关系，从而影响其生长和定植。本研究通过体外发酵实验，分析了生物膜态长双歧杆菌对肠道菌群的影响，及其在特定肠道菌群背景下的增殖情况。主成分分析结果表明，经体外发酵后，菌群组成发生了明显的变化，其中生物膜组存在更显著的聚类（图 6A）。相对于发酵前的样品（对照组-0h），在门水平上，对照组、生物膜组和浮游组在发酵 24 h 后放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度均有所增加，其中生物膜组达到 26.69%；而生物膜组的拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度（13.25%）明显低于其他组样本（图 6B），这可能是由于物种间的竞争导致。在属水平上，生物膜组和浮游组的双歧杆菌属（Bifidobacterium）的丰度明显增加，这与 BL-BOA-7 的加入有关，其中生物膜组的双歧杆菌丰度达到 25.96%，是浮游组（11.86%）的 2 倍以上（图 6C），说明在接种量一致的情况下，生物膜态长双歧杆菌在正常肠道菌群的背景环境下，具有更强的竞争性和增殖能力，因此有助于菌株在肠道中的定植。
Fig.6 Results of microbial community of in vitro fermentation system
注：A 为各组样品菌群组成的主成分分析结果；B 为各组样品在门水平上的微生物组成；C 为各组样品在属水平上的微生物组成。
为进一步在中水平上分析本研究中的长双歧杆菌在体外发酵体系中的增殖情况，我们利用长双歧杆菌种特异性引物和定量 PCR，测定了体外发酵过程中长双歧杆菌的数量变化，结果如图 7 所示。在发酵 0 h 时，由于 BL-BOA-7 的接入，生物膜组和浮游组的长双歧杆菌数量明显高于对照组（P<0.05）。随着发酵过程的发展，各组长双歧杆菌的数量均有所增加；其中生物膜组的增殖速率最高，发酵 24 h 时，生物膜组长双歧杆菌的数量增长了 13.64 倍，而浮游组增长了 7.23 倍。实验结果表明，生物膜组长双歧杆菌在肠道环境中的具有更强的增殖能力。双歧杆菌通过形成生物膜可以为其内部的菌体提供更加适宜的生长条件，例如提高菌株的抗逆性和营养。在形成生物膜的过程中菌体分泌的胞外多糖可以从周围环境中吸收营养物质，促进菌株的增殖，从而提高菌株在肠道环境中的竞争能力。
图 7 体外发酵过程中长双歧杆菌的数量变化
Fig.7 Quantity of Bifidobacterium longum during in vitro fermentation
注：图中柱状图代表长双歧杆菌数量（参照主坐标）；折线图代表长双歧杆菌的增值倍数（参照次坐标）。
2.3.2 生物膜态长双歧杆菌对短链脂肪酸组成的影响
短链脂肪酸是肠道微生物的代谢产物，对维持肠道功能稳态、调节代谢和免疫具有重要作用。体外发酵过程中短链脂肪酸的测定结果表明（表 1），随着发酵时间的延长，各组发酵液中短链脂肪酸的含量均呈现不断增加的趋势，这与微生物的不断增长和代谢有关。在发酵 24 h 后，生物膜组的乙酸、丙酸、丁酸的合成量显著高于对照组和浮游组（P<0.05），且浮游组和对照组之间无显著差异（P>0.05）。HenriqueBana 等通过体外发酵实验研究了乳双歧杆菌和益生元对肠道菌群和短链脂肪酸的影响，发现单独加入双歧杆菌不影响短链脂肪酸的组成，而单独加入益生元或混合加入双歧杆菌和益生元可显著增加短链脂肪酸的浓度。双歧杆菌具有丰富的糖基水解酶，水解复杂碳水化合物的能力较强，可通过互养作用为其他产短链脂肪酸的微生物（如 Faecalibacterium、Eubacterium 和 Roseburia 等）提供底物。此外，双歧杆菌具有较强的产乙酸能力，可通过降低环境pH 调节肠道微生物的组成。因此，本研究中，生物膜态长双歧杆菌对短链脂肪酸的影响可能与其较强的增殖能力以及对菌群组成的调节有关。
Table 1 Changes of short chain fatty acids during in vitro fermentation
双歧杆菌是一类重要的益生菌，然而其对环境胁迫较敏感，容易导致活性降低。生物膜态 BLBOA-7 在氧暴露、热处理、冷冻干燥和模拟胃肠液等应激环境具有更高的存活率，并具有强的黏附性；体外发酵结果表明，生物膜态长双歧杆菌的加入可显著影响发酵体系的微生物组成，并增加双歧杆菌属的相对丰度以及长双歧杆菌的绝对数量。本研究表明，基于膳食纤维制备生物膜态双歧杆菌，可有效提高菌体的抗逆性和肠道增殖能力，有望用于开发高活性双歧杆菌制剂和相关功能性食品。
引用本文：闫爽，崔文明，王钰钦，等. 生物膜态长双歧杆菌长亚种的抗逆性及其对肠道菌群的影响[J]. 食品工业科技，2025，46（16）：155−162. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024050398.
Citation: YAN Shuang, CUI Wenming, WANG Yuqin, et al. Stress Resistance of Biofilm-type Bifidobacterium longum subsp. longum and Its Effect on Intestinal Microbiota[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(16): 155−162. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024050398.
基金项目：河南省重点研发与推广专项项目（科技攻关）（242102110094）；广西康养食品科学与技术重点实验开放课题（GXKYSYS202205）；河南农业大学2023年大学生创新训练计划项目（2023CX140）。
赵改名，河南农业大学食品科学技术学院二级教授、博士生导师。国家现代农业肉牛与牦牛产业体系岗位科学家，河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室主任，河南省高校学术技术带头人，河南省高校科技创新人才。任中国畜产品加工研究会常务理事、河南省农产品加工与贮藏工程学会副会长等学术兼职。长期从事肉品加工与品质控制的研究，先后主持完成国家、省部级项目共20余项，取得科研成果20余项，获国家、省部级科技奖励14项，国家授权专利22项，出版著作10多部，发表论文300余篇。。
王小鹏，河南农业大学食品科学技术学院副教授，研究方向：乳品加工与安全、乳成分结构与营养、乳酸菌开发及应用。河南省乳品工程技术研究中心主任、河南省乳制品产业技术创新战略联盟副理事长兼秘书长、中国乳制品工业协会法规标准技术委员会委员。2018-2022年度，连续5个年度，河南省优秀科技特派员；河南农业大学优秀共产党员；河南农业大学优秀教师。
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