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摘要
为研究黑玉米芯多糖的提取方法，以及其对α-糖苷酶的抑制活性，本研究以黑玉米芯为原料，采用超声辅助低共熔溶剂法提取黑玉米芯多糖。以多糖得率和α-糖苷酶的抑制率为指标，筛选最佳低共熔溶剂，并对黑玉米芯多糖的总糖、还原糖、蛋白质及糖醛酸含量进行测定。分别利用离子色谱法、高效凝胶色谱法、傅里叶红外光谱法分析黑玉米芯多糖的单糖组成、分子量分布和官能团特征。通过测定黑玉米芯多糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率，并结合酶促反应动力学研究其抑制类型。结果表明：超声辅助尿素-氯化胆碱的组合制备的黑玉米芯多糖得率最高为5.43%±0.49%。黑玉米芯多糖的总糖含量为78.0%±2.27%，还原糖含量为17.2%±0.24%，多糖含量为60.8%±0.68%，糖醛酸含量为3.76%±0.43%，蛋白质含量为4.21%±0.18%。黑玉米芯多糖由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸组成，呈现出典型的多糖特征吸收峰，具有吡喃环结构，存在α和β型糖苷键。重均分子量为29487 Da，数均分子量为29285 Da。酶促反应动力学研究表明，黑玉米芯多糖对α-葡萄糖苷酶以及α-淀粉酶表现出较强的抑制活性，IC50值分别为2.49和6.06 mg/mL。抑制类型为可逆性抑制，竞争方式为高活性竞争，Km值分别为0.44和1.746 mg/mL，Vmax分别为0.04和0.37。超声辅助低共熔溶剂提取法能提高黑玉米芯多糖的得率，且得到的黑玉米芯多糖对α-糖苷酶的抑制作用较强。
黑玉米（Zea mays L.）隶属于被子植物门单子叶植物纲禾本目玉蜀黍属，又称紫玉米，为玉米品种中的一个独特变种。黑玉米原产于南美安第斯山区。我国于20世纪末引进培育成功，目前已选育出几十个对我国栽培环境适应性强的品种。黑玉米资源丰富，现已广泛分布于东北地区、华北地区、华南地区、西北地区等。相较于传统玉米品种，黑玉米不仅含糖量更高，而且营养价值显著，兼具食用和药用价值。黑玉米最常用的部位为玉米粒，然而大量研究发现黑玉米芯中富含多糖、VC、花青素、类黄酮、酚类化合物等多种活性成分，经现代药理研究证实，这些成分在降血糖、抗氧化、降血脂以及免疫调节等方面展现出显著效果。但是目前黑玉米芯因缺乏有效利用而被丢弃或焚烧处理，造成了严重的资源浪费并增加了环境承载压力。因此充分利用黑玉米芯是解决这一问题的有利途径。
玉米芯多糖的提取方法通常包括热水浸提法、酸碱浸提法、超临界萃取法和酶法等。其中热水浸提法操作较为简单，但存在耗时长、提取率低的问题，且长时间的热处理容易导致多糖结构被破坏。低共熔溶剂（Deep eutectic solvents，DESs）是一种由受氢体与供氢体组成的两组分或多组分低共熔混合物，是一种新型绿色的提取介质。它具有不易挥发、毒性微小、环保性优良以及无需纯化等优势，被广泛应用于天然活性成分的提取。有研究发现，DESs提取更有利于保留多糖的生物活性。例如袁书会等分别运用水提醇沉法和氯化胆碱-尿素组合的低共熔溶剂法提取酸枣果肉多糖，研究发现在相同浓度下，DESs所得多糖溶液对α-葡萄糖苷酶抑制活性优于水提醇沉法所得的多糖溶液。近年来，超声、微波等物理手段多被应用于辅助多糖的提取，尤其是超声辅助提取（Ultrasonic-assisted extraction，UAE），它是一种高效、节能、环保的生物活性成分提取方法。超声辅助低共熔溶剂在提取多糖方面展现出了很强的协同作用，在超声辅助的条件下，高效、短时地释放出多糖物质，并且DESs内部的结构可以与目标多糖之间形成氢键并产生静电相互作用，从而显著提高多糖的提取率。然而目前超声辅助低共熔溶剂用于玉米芯多糖提取的报道鲜少。
本研究以黑玉米芯为原料，利用超声辅助低共熔溶剂法提取黑玉米芯多糖（Polysaccharides from black corncob，BCP），结合多糖得率及其对α-糖苷酶的抑制率综合筛选最佳的提取溶剂。测定黑玉米芯多糖的化学成分、研究黑玉米芯多糖的分子量分布、单糖组成及对α-糖苷酶抑制活性的影响。旨在为提高黑玉米资源的综合利用水平和产品附加值提供依据。
结果与分析
2.1 不同提取方法对黑玉米芯多糖得率的影响
超声法（UBCP）、低共熔溶剂法（DES-1至DES-5）及超声辅助低共熔溶剂法（DES-6至DES-10）提取的多糖得率如图1所示。相较于单独的低共熔溶剂法和超声法，超声辅助低共熔溶剂法提取的多糖得率显著提高（P<0.05），这可能是由于超声的空化效应、机械振动效应以及热效应协同作用的结果。在超声辅助的作用下，DESs能够与多糖分子形成更为有效的相互作用，形成氢键，促使多糖更有效的溶出。在超声辅助低共熔溶剂法中，以酰胺类和多元醇类为供氢体的DESs提取黑玉米芯多糖的效率较高，其中超声辅助氯化胆碱-尿素组合提取的黑玉米芯多糖的得率最高，为5.43%±0.49%，显著高于其余几种DESs（P<0.05）。可能由于多糖和低共熔溶剂都具有极性，其中氯化胆碱-尿素体系的扩散力和极性与黑玉米芯多糖更为接近，对其亲和力更强，利于多糖溶解和扩散。因此，以上结果显示，超声辅助低共熔溶剂法是提取黑玉米芯多糖的最优选择。
图 1 不提取方法对黑玉米芯多糖得率的影响
Figure 1. Effect of extraction methods on the yield of polysaccharides from black corncob
注：不同的字母表示显著差异，P<0.05；图2、图6、图8同。
2.2 不同方法提取黑玉米芯多糖的α-糖苷酶抑制率
基于上述结果，选取氯化胆碱-尿素、氯化胆碱-柠檬酸、氯化胆碱-1,4-丁二醇这三种得率较高的溶剂组合用于黑玉米芯多糖的提取，并探究其对α-糖苷酶的抑制作用。实验结果如图2A显示，超声辅助氯化胆碱-尿素组合提取的多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制效果最为显著（P<0.05），其抑制率高达72.9%；如图2B显示，在对α-淀粉酶抑制率的测定中，氯化胆碱-尿素组合提取的多糖也表现最佳，其抑制率高达63%，显著高于其他两种DESs提取的黑玉米芯多糖（P<0.05）。这可能因为氯化胆碱-尿素对多糖具有更好的溶解性，对多糖的天然空间结构破坏较小，生物活性保留较好。综合考量多糖得率及对α-糖苷酶抑制活性的影响，本研究选定超声辅助氯化胆碱-尿素组合的DESs作为后续研究的溶剂体系。
图 2 不同方法提取黑玉米芯多糖的α-葡萄糖苷酶（A）、α-淀粉酶（B）抑制率
Figure 2. Inhibition rates of α-glucosidase (A) and α-amylase (B) polysaccharides from black corncob extracted through diverse methods
2.3 黑玉米芯多糖中化学组成的分析
如表3所示，BCP的总糖含量较高，为78.0%±2.27%，还原糖含量为17.2%±0.24%，多糖含量为60.8%±0.68%，表明多糖是BCP的主要成分。本研究中BCP的总糖醛酸含量为3.76%±0.43%，据报道，多糖中的糖醛酸含量对其的生物活性有很大影响。此外，在BCP中检测到了微量蛋白质，这表明其中可能存在微量多糖-蛋白质复合物。这些结果与谢静南提取的甜玉米芯多糖含量不同，谢静南运用热水浸提法提取甜玉米芯多糖总糖含量为30.553%±1.27%，还原糖含量为1.318%±0.09%，多糖含量为29.235%，该差异可能与玉米芯的产地品种、多糖提取方法的不同有关。
表 3 黑玉米芯多糖中化学组成的分析
Table 3. Analysis of the chemical composition of BCP
2.4 黑玉米芯多糖性质分析
2.4.1 黑玉米芯多糖傅里叶红外光谱分析
黑玉米芯多糖红外光谱图的解析结果如图3所示，在4000~500 cm−1范围内，黑玉米芯多糖呈现出多糖的典型特征吸收峰。位于3294.9 cm−1的宽强吸收峰归因于糖残基中O-H的伸缩振动；在2919.2 cm−1附近出现的较强吸收峰，则反映了糖类不对称C-H的伸缩振动，可能包含-CH2或-CH3基团。1629.1和1516.1 cm−1两处出现的明显吸收峰为-COO-基团中对称和不对称C=O的拉伸振动。在1200.0~1000.0 cm−1范围内，表明存在糖苷键的C-O、C-O-C和O-C-O振动，以及与多糖侧基的C-O-H拉伸振动的重叠。其中，位于1195.8和1013.8 cm−1有吸收峰，表明存在吡喃环结构。此外，在850.2 cm−1附近出现的吸收峰，说明存在α和β型糖苷键。这些结果与陈晓楠稀碱法提取的玉米芯多糖相似，其在4000~400 cm−1范围内也具有糖类的多种官能团。
图 3 黑玉米芯多糖傅里叶红外光谱分析
Figure 3. Fourier transform infrared spectrum analysis of BCP
2.4.2 黑玉米芯多糖分子量分布
研究表明天然多糖的生物活性与其分子量大小和单糖组成密切相关。因此，采用高效凝胶渗透色谱法测定BCP的分子量，结果如图4所示，可知DESs制备的BCP的HPGPC谱图为单一对称峰，说明均一性较好。由标准曲线方程计算可得到其重均分子量为29487 Da；数均分子量为29285 Da；BCP的分子量分布与孙姝兰等采用水提法提取玉米芯多糖有差异，其测定的玉米芯多糖的分子量为138 kDa，表明不同提取方法制备的多糖分子量不同。
图 4 黑玉米芯多糖的高效凝胶渗透色谱图
Figure 4. High performance gel permeation chromatogram of BCP
2.4.3 黑玉米芯多糖单糖组成分析
黑玉米芯多糖的单糖组成的结果如图5、表4所示，结果表明BCP由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖和岩藻糖组成，且含有少量葡萄糖醛酸。其摩尔百分比分别为76.3%、10.3%、7.7%、4.4%、1.0%、0.3%。结果表明葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖是黑玉米芯多糖的主要单糖，并且BCP是一种以葡萄糖为主的多糖。张静静通过热水浸提法提取玉米芯多糖，采用薄层层析技术分析玉米芯单糖组成，发现其包含葡萄糖、L-阿拉伯糖和木糖，以上结果与本研究结果相似。
Figure 5. Ion chromatographic analysis of monosaccharide standards (A) and ion chromatographic determination of monosaccharides in BCP(B)
表 4 黑玉米芯多糖单糖组成分析
Table 4. Analysis of monosaccharide composition of BCP
2.5 黑玉米芯多糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用
2.5.1 黑玉米芯多糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性
不同浓度的BCP对α-葡萄糖苷酶的抑制作用如图6所示，在浓度0.5~6.0 mg/mL的范围内，BCP对α-葡萄糖苷酶的抑制作用呈现正相关，在浓度为0.5 mg/mL时，BCP对α-葡萄糖苷酶的抑制率为27.67%，当浓度增加到6.0 mg/mL时，抑制率达到87.65%，此时IC50值为2.49 mg/mL，阳性药物阿卡波糖IC50值为1.243 mg/mL。在相同浓度条件下，黑玉米芯多糖抑制活性低于阿卡波糖抑制活性，这可能与阿卡波糖的纯度远高于提取的黑玉米芯多糖有关。以上结果显示BCP具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制作用。根据文献报道，含有α-1,4糖苷键和糖醛酸的多糖具有较强的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，与本研究傅里叶红外光谱结果一致。
图 6 黑玉米芯多糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用
Figure 6. Inhibitory effect of BCP on α-glucosidase activity
2.5.2 黑玉米芯多糖对α-葡萄糖苷酶抑制动力学的研究
通过探究BCP对α-葡萄糖苷酶酶促反应速度与酶浓度的关系，判断其对α-葡萄糖苷酶的抑制类型。如图7A所示，在底物浓度不变的情况下，反应速率与α-葡萄糖苷酶的量成正比，且不同浓度的BCP反应速率直线均经过原点，斜率随着BCP浓度的增大而变小。表明BCP对α-葡萄糖苷酶的抑制为可逆性抑制。通过Lineweaver Burk方法绘制双倒数曲线，并分析米氏常数Km和最大酶解速率Vmax值的变化。如图7B所示，三条直线在允许误差范围内均交于Y轴相同一点，无抑制剂组（0 mg/mL）Km值为0.44，Vmax为0.04。随着抑制剂BCP的加入，反应速率呈现下降趋势，双倒数直线在横坐标轴的截距变小，在纵坐标轴的截距不变，根据抑制动力学参数的结果表明，在BCP浓度为3 mg/mL时，α-葡萄糖苷酶的Km1值为0.74；在BCP浓度为6 mg/mL时，α-葡萄糖苷酶的Km2值为1.05。Km2>Km1，由此可知抑制剂浓度越高，Km值越大，且Vmax不变，BCP与底物具有类似的结构从而共同竞争酶活性，为典型的竞争性抑制剂，故BCP是一种竞争性的α-葡萄糖苷酶抑制剂。这与甜玉米芯多糖对α-葡萄糖苷酶活性的竞争方式相似。
图 7 黑玉米芯多糖对α-葡萄糖苷酶抑制类型图（A）和抑制动力学图（B）
Figure 7. α-Glucosidase inhibition patterns (A) and kinetics (B) of BCP
2.6 黑玉米芯多糖对α-淀粉酶抑制作用
2.6.1 黑玉米芯多糖对α-淀粉酶抑制活性
BCP对α-淀粉酶的抑制作用如图8所示，在浓度为2~10 mg/mL 的范围内，BCP对α-淀粉酶的抑制能力随浓度增加而增大，呈剂量依赖性。在浓度为2 mg/mL 时，BCP对α-淀粉酶的抑制率仅为21.46%，当浓度增加到10 mg/mL时，其抑制率就已达到了69.21%，其IC50值为6.059 mg/mL，虽然与临床药物阿卡波糖（IC50=2.355 mg/mL）相比，BCP对α-淀粉酶的抑制能力略低，但其易于生产、绿色天然，仍然是一种较为理想的α-淀粉酶抑制剂。这一结果与王鑫提取的甜玉米芯多糖结果相似，运用热水浸提法提取甜玉米芯多糖，当浓度增大到10 mg/mL时，其对α-淀粉酶抑制率达到了75.44%±1.94%，IC50值为5.129±0.34 mg/mL。
图 8 黑玉米芯多糖对α-淀粉酶活性抑制作用
Figure 8. Inhibition of α-amylase activity by BCP
2.6.2 黑玉米芯多糖对α-淀粉酶的抑制动力学
如图9A所示，通过拟合得到了一组过原点的直线，由图可知，随着BCP浓度的增加，直线的斜率在不断降低，说明BCP对α-淀粉酶的抑制作用是可逆的。根据 Lineweaver-Burk方法绘制双倒数曲线，由图9B可知，三条直线在允许误差范围内均交于Y轴相同一点，可以得出，无抑制剂组（0 mg/mL）α-淀粉酶的Km值为1.746 mg/mL，Vmax为0.365。随着抑制剂黑玉米芯多糖溶液的加入，反应速率相对于无抑制剂组呈现下降趋势，且根据抑制动力学参数的结果表明当BCP浓度为3 mg/mL，α-淀粉酶的Km1值为4.29 mg/mL，当BCP浓度为10 mg/mL时，α-淀粉酶的Km2值为6.68 mg/mL。可知Km2>Km1，且Vmax不变，黑玉米芯多糖与底物具有类似的结构，共同竞争酶的活性中心，为典型的竞争性抑制剂，故BCP是一种竞争可逆性的α-淀粉酶抑制剂。这与甜玉米芯多糖对α-淀粉酶活性的竞争方式相似。
图 9 黑玉米芯多糖对α-淀粉酶的抑制类型（A）和抑制动力学曲线（B）
Figure 9. Inhibition type (A) and inhibition kinetics curves (B) of α-amylase inhibition by BCP polysaccharide
黑玉米芯含有多种活性成分，具有极大的开发价值。本研究以黑玉米芯为原料，采用超声辅助DESs法高效提取黑玉米芯多糖。最佳低共熔溶剂为氯化胆碱-尿素、摩尔比为2:1。在此条件下，黑玉米芯多糖得率为5.43%±0.49%，总糖含量为78%±2.27%，还原糖含量为17.2%±0.24%，多糖含量为60.8%±0.68%，糖醛酸含量为3.76%±0.43%，蛋白质含量为4.21%±0.18%。黑玉米芯多糖由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸组成。分子量分布均一，重均分子量为29487 Da，数均分子量为29285 Da。具备多糖的特征吸收峰，并且对α-葡萄糖苷酶以及α-淀粉酶表现出较强的抑制活性，IC50值分别为2.49 mg/mL和6.06 mg/mL，均表现出竞争可逆性抑制。本研究采用超声辅助低共熔溶剂法提取的黑玉米芯多糖，其抑制α-糖苷酶活性的研究仍处于起步阶段，后续研究可建立具有代表性的药理模型，通过体外细胞实验和体内动物实验进一步探究其降糖作用机制，并利用黑玉米芯多糖研发功能性降血糖食品，为黑玉米的深度开发提供理论支撑。
Citation: YUN Han, YU Xi, LI Fangfei, et al. Extraction of Polysaccharides from Black Corncob Using Ultrasonic-assisted Deep Eutectic Solvent and Its Activity in Inhibiting α-Glycosidase[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(14): 153−162. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024070365.
基金项目：黑龙江省科学基金优秀青年项目（YQ2020C014）。
通信作者简介
柴洋洋，理学博士，副教授，硕士生导师。黑龙江省食品科学技术学会青年工作委员会副秘书长，黑龙江省天然产物工程学会理事。主要从事药食同源资源活性成分挖掘、功能食品开发、功能因子及食品与肠道微生物的交互作用及影响机制研究。主持国家自然科学基金青年基金、黑龙江省自然科学基金优秀青年基金等横纵向项目10余项。目前在国内外期刊上发表论文30余篇，其中SCI论文15篇；出版专著1部，参编教材2部，参与制定黑龙江省地方标准1项。
（以上信息来自东北林业大学生命科学学院官网）
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