国家重点研发计划|西南林业大学张雪春教授和浙江省农业科学院夏其乐研究员：椪柑陈皮总黄酮大孔树脂纯化工艺优化及其体外活性分析- 大数跨境

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国家重点研发计划|西南林业大学张雪春教授和浙江省农业科学院夏其乐研究员：椪柑陈皮总黄酮大孔树脂纯化工艺优化及其体外活性分析

食品工业科技编辑部

2026-03-06

导读：欢迎投稿EI期刊《食品工业科技》www.spgykj.com

EI收录，

入选中国科技期刊卓越行动计划

本文获国家重点研发计划资助（2024YFD2100603）；国家现代农业产业技术体系（CARS-26-04BY）。

摘要

为探究椪柑陈皮黄酮（Ponkan Chenpi flavonoids，PCf）的纯化工艺及其体外抗氧化和降血糖活性，本研究通过超声辅助溶剂提取法提取PCf，研究四种大孔树脂对PCf的静态吸附解吸效果，筛选出最佳的大孔树脂，利用单因素实验对纯化工艺进行优化。同时，探究纯化前后PCf对DPPH自由基清除率、ABTS⁺自由基清除率、铁离子还原能力等抗氧化效果；同时探究其对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。结果显示，HPD-500大孔树脂对PCf的纯化效果最好，得到纯化的最佳条件是pH为2，乙醇浓度为80%，上样流速4 mL/min，洗脱流速3 mL/min，上样量与洗脱量比例为1:1.6。经过大孔树脂纯化后有效降低了样品还原糖含量，提高了总黄酮的含量（132.2±9.62 mg RE/g DW)。纯化后的PCf抗氧化和降血糖活性都达到更好的效果，ABTS⁺自由基清除率达到93.75%±0.82%，DPPH自由基清除率达到77.42%±0.91%，铁离子还原能力为纯化前的2倍，对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到66.84%±0.67%。综上，HPD-500适用于椪柑陈皮总黄酮的初步分离纯化，且纯化后的产物表现出良好的抗氧化活性和对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，为椪柑陈皮的进一步开发提供参考。

作为最古老且有效的食品保鲜技术，低温贮藏在维持肌肉食品、水果和蔬菜的安全及质量方面发挥着关键作用，根据贮藏环境温度的不同，现代工业中通常以冷藏（0~4 ℃）和冷冻（低于−18 ℃）两种方式来提高产品的品质稳定性。近年来，与传统肉制品相比，调理牛排因其食用方便、营养均衡等优势，越来越受到消费者的青睐。调理牛排产品通常采用冷藏或者冷冻方式进行贮运销售。传统的冷藏技术货架期较短，难以进行长线的冷链运输；此外，尽管冷冻技术可以大幅度延长货架期，但是贮藏过程中冰晶的生长/再结晶会对肌肉组织造成剧烈的机械损伤，解冻后过多的汁液损失会直接损害行业的经济效益和消费者的健康需求。因此，有必要开发新型的低温保存技术以维持食品原有的品质。

椪柑（Itrus reticulata Blanco cv. Ponkan），芸香科柑橘属木本植物，主产于福建、浙江、湖南、四川等地区。衢州是浙江省重点柑橘产区，其中以椪柑最有名，“衢州椪柑”是国家地理标志保护产品，在该地区已经有千年的种植历史，衢州椪柑具有“皮薄肉香”的特点，每年都有大量的原料用于果汁和囊胞的加工，同时会产生大量的果皮，民间有对橘皮进行晾晒制作陈皮的习惯。陈皮（Chenpi）是芸香科植物橘及其栽培变种的干燥果皮，是我国传统的药食同源物质之一，素有“陈久者良”的说法。近年来，关于陈皮的研究主要集中于广陈皮，柑橘品种是产于新会的茶枳柑。研究证明，随着陈化年份的增加，陈皮中主要的活性成分类黄酮含量也会随着陈皮陈化时间的增加而逐渐增加，使其药理作用更强。但椪柑陈皮缺乏系统研究，其中富含的黄酮成分未得到充分开发和利用。

黄酮类化合物是柑橘果皮中最重要的生物活性成分之一。柑橘黄酮类化合物被认为具有多种药理作用，如抗氧化、抗炎、抗癌、降血脂，在医药、食品、保健品和化妆品等领域具有一定的商业化应用潜力。大孔树脂被广泛用于分离纯化，可以有效去除糖分和其他杂质，提高目标化合物的纯度。穆莎茉莉等用D101大孔树脂纯化蓖麻叶总黄酮，纯度达到了56.34%；朱成成等用AB-8纯化蓝莓果葡糖浆中的花色苷，对还原糖的去除率达到84.13%，杜国军等用DM301对酸枣仁总黄酮进行纯化，纯化物的纯度达到38.7%。目前关于采用大孔树脂纯化椪柑陈皮黄酮的工艺未见报道，适宜的大孔树脂填料尚不明确，其体外抗氧化和降血糖活性也缺乏研究。

本研究以衢州椪柑陈皮为原料，采用超声波辅助溶剂提取法提取椪柑陈皮黄酮（Ponkan Chenpi flavonoids，PCf），开展单因素实验确定其最佳的大孔树脂纯化工艺。进一步通过傅里叶红外光谱鉴定化合键，研究纯化前后陈皮黄酮的抗氧化活性及对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。该研究旨在明确椪柑陈皮黄酮的相关活性，促进椪柑果皮的高值化利用，并且可以为椪柑果皮的药食两用提供重要的依据。

结果与分析

2.1 椪柑陈皮黄酮类化合物的定性

图1是8种标准品和PCf在283 nm和330 nm的色谱图，图1中第三个峰橙皮苷的峰强度高，即PCf中的含有丰富的橙皮苷，含量达到48.71±0.82 mg/g，符合中国药典对陈皮中含橙皮苷（≥3.5%）的要求。橙皮苷在不同的抗氧化模型（DPPH自由基清除、超氧阴离子清除、还原力和金属螯合作用）中显示出比橙皮素更有效的抗氧化活性。多甲氧基黄酮是柑橘属中特有的成分，研究证明，多甲氧基黄酮在抗氧化和抗肿瘤方面具有更强的生物活性。从图1可以看出椪柑陈皮中含有川陈皮素、桔皮素、HMF和5-去甲基川陈皮素。黄烷酮以柑橘类植物中的糖苷和糖苷配基形式存在，柚皮苷和橙皮苷水解后可得到柚皮素和橙皮素，是最重要的糖苷配基形式，柑橘黄烷酮已被证明通过清除自由基表现出抗氧化活性，这是许多其他生物活性的基础。因此，椪柑陈皮具有研究抗氧化活性的潜力。

图 1 混合标准品色谱图和PFs色谱图

Figure 1. Chromatograms of mixed standards and PFs

注：1. 芸香柚皮苷；2. 柚皮苷；3. 橙皮苷；4. 新橙皮苷；5. 川陈皮素；6. HMF；7. 桔皮素；8. 5-去甲基川陈皮素。

2.2 大孔树脂筛选

大孔树脂的吸附和解吸能力影响目标产物的纯化效果，4种大孔树脂的物理性质如表2所示，4种大孔树脂对PCf的吸附和解吸的能力如表2所示。通过静态吸附和解吸实验发现，这4种大孔树脂的吸附率依次为AB-8>HPD-500>HP-20>D101，解吸率依次为HP-20>HPD-500>AB-8>D101。AB-8对PCf的吸附率最高，但HPD-500对PCf的解吸率最高，从表1可知HPD-500大孔树脂的比表面积为570~600 m²/g，比其他3种更大，更有利于解吸时乙醇充分渗透空隙，高效洗脱PCf。因此，结合吸附-解吸性能后，确定用HPD-500作为PCf的纯化材料。

表 2 四种大孔树脂的吸附-解吸能力

Table 2. Adsorption-desorption capacity of four macroporous resins

注：不同小写字母表示不同大孔树脂组间的显著性差异（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。

2.3 HPD-500树脂吸附动力学曲线

图2A为大孔树脂对PCf的吸附曲线，吸附率随着时间增加而增加，在0~30 min之间，吸附量迅速上涨，在30 min吸附率为79.13%±0.30%，30 min后吸附率的变化趋于平缓，在2.5 h时，大孔树脂吸附率最高值可达79.45%，超过150 min时，吸附率降低，表明树脂在接近饱和时会发生自脱附，吸附和脱附在同时发生。

图 2 HPD-500大孔树脂对PCf的吸附动力学

Figure 2. Adsorption kinetics of HPD-500 macroporous resin for PCf

注：A. 大孔树脂吸附曲线；B. 准一级动力学模型；C. 准二级动力学模型；D. 粒子内扩散模型。

将吸附动力学的数据拟合到准一级动力学、准二级动力学和颗粒扩散模型，由图2B、图2C和表3中的拟合参数表明，准二级动力学模型方程拟R²值（0.9997）高于准一级动力学模型方程R²值（0.8972），表明准二级动力学对于HPD-500对PCf吸附过程的阐释更准确，结果与Wu等纯化枸杞黄酮类化合物的研究结果一致。由准二级动力学方程计算得到最大的理论吸附量为0.7 mg/mL，与实际最大吸附量0.699 mg/mL非常接近，由图2D可见，PCf溶液在粒子内扩散模型涉及三个阶段，更加清晰地表示PCf通过溶液扩散到HPD-500的运动过程，在第二阶段为高速吸附阶段，R²为0.9163，且第三阶段趋于平衡。所以HPD-500对PCf的吸附是逐步从表面扩散到孔内扩散，孔内扩散是总黄酮吸附的主要阶段。

表 3 动力学模型拟合方程及模型参数

Table 3. Kinetic model fitting equations and model parameters

2.4 静态解吸曲线

图3为HPD-500大孔树脂的静态解吸曲线，在0~1 h的时间范围内，HPD-500大孔树脂对PCf的静态解吸速率增长最快；在1 h时，解吸率已经达到93.33%±3.06%，随后在2 h达到了97.26%±1.88%，3.5 h时达到最高值98.36%±1.05%，4 h之后，PCf浓度趋于平缓，选择2 h为解吸时间较为理想。

图 3 大孔树脂静态解吸曲线

Figure 3. Static desorption curve of macroporous resin

2.5 大孔树脂静态单因素实验

2.5.1 pH对HPD-500大孔树脂吸附效果的影响

溶液的pH对大孔树脂的吸附能力有显著影响，图4为不同pH对吸附能力的影响。从图3可知，随着pH的增加，大孔树脂对PCf的吸附能力逐渐减小。在当pH=2时，HPD-500吸附率达到最高值95.32%±0.59%，与其他pH为4、5、6、7的吸附率有显著的区别（P<0.05）；当pH超过3时，HPD-500大孔树脂对黄酮的吸附率逐渐下降。当pH为中性时，吸附率降低至71.14%±4.07%；推测可能因为黄酮类化合物含有酚羟基而呈现一定的酸性，在酸性条件下容易与树脂产生氢键作用，从而更易被吸附。

图 4 pH对HPD-500大孔树脂吸附能力的影响

Figure 4. Effect of pH on the adsorption capacity of HPD-500 macroporous resin

注：不同小写字母表示显著性差异（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05），图5~图8同。

2.5.2 乙醇浓度对HPD-500大孔树脂解吸效果的影响

由图5可以发现乙醇浓度从20%增加到80%时，对PCf的洗脱逐渐增高。当洗脱液为纯水时或者20%乙醇时，吸附在树脂上的黄酮类化合物不易被水和低浓度乙醇解吸；洗脱效果最好的浓度为80%乙醇，其解吸率高达96.23%±2.35%，与0%~60%及95%浓度的乙醇洗脱液有显著的差异（P<0.05）；当乙醇浓度为95%时解吸率反而下降了，可能是乙醇浓度增大，洗脱剂极性变小，溶剂分子不能和HPD-500树脂形成氢键作用，难以将树脂上的黄酮类化合物分子置换下来，导致黄酮类化合物不容易解吸。因此，选择乙醇浓度为80%。

图 5 乙醇浓度对HPD-500大孔树脂解吸效果的影响

Figure 5. Effect of ethanol concentration on the desorption efficiency of HPD-500 macroporous resin

2.6 大孔树脂动态单因素实验

2.6.1 上样流速对HPD-500大孔树脂吸附效果的影响

如图6所示，在较低的流速下，溶液与树脂之间接触时间的延长逐渐增加吸附率。当流速为1 mL/min时，吸附率达到94.12%±0.23%，流速为5 mL/min时，吸附率为89.32%±0.27%。因此，控制流速可以提高吸附率。过快的流速可能导致溶液和树脂之间的接触时间不足，这导致有效成分的不完全吸附和黄酮类化合物泄漏增加，降低了吸附率和吸附量。因此，流速4 mL/min为最佳上样流速。

图 6 上样流速对HPD-500大孔树脂吸附效果的影响

Figure 6. Effect of sample loading flow rate on the adsorption performance of HPD-500 macroporous resin

2.6.2 洗脱流速对HPD-500大孔树脂解吸效果的影响

和PC2的正向端，靠近绝大多数乙酸高级醇酯、脂肪酸乙酯与高级醇。主成分分析明晰了各发酵模式下的潜在香气成分的差异性，指明混菌发酵体系内的香气物质生成受制于主导菌株。同时接种发酵体系中，S. cerevisiae强烈抑制了H. osmophila的生长与氨基酸的摄取，因而表现为类似于Sc酒样的香气组分。在顺序接种发酵体系中，由于H. osmophila提前消耗偏好性氨基酸，使其有能力对抗后续接种的S. cerevisiae，从而保证了自身产酯效能的发挥，最终使SEQ酒样保留了S. cerevisiae的脂肪酸乙酯生成活性，同时也发挥了H. osmophila的乙酸乙酯和乙酸高级醇酯的生成优势。

2.6.3 洗脱剂用量对HPD-500大孔树脂解吸效果的影响

根据图8可以发现上样液与洗脱液的比例从1:0.8到1:1时，大孔树脂的解吸率快速上升，随着洗脱液的用量逐渐增加，洗脱液对树脂的解吸效果也更好。当上样液和洗脱液的比例为1:0.8的时候，解吸率最低，可能是因为洗脱剂的用量难以洗脱全部的黄酮。当上样液和洗脱液的比例为1:1.6时，解吸率最高94.27%±1.14%，且解吸量也达到最高，与其他洗脱体积下的解吸量有显著区别（P<0.05）。因此，选择上样液与洗脱液的体积比为1:1.6。

图 8 洗脱剂用量对HPD-500大孔树脂解吸效果的影响

Figure 8. Effect of ethanol volume on the desorption efficiency of HPD-500 macroporous resin

2.6.4 动态解吸曲线

根据以上单因素所得出的最佳条件，测定动态下的解吸曲线。图9为动态解吸曲线，可以发现，解吸峰在12管之后开始出现，30管之后趋于平缓，为了使纯化后PCf的纯度更高，因此选择12~30管进行收集，减压浓缩后进行冻干。

图 9 动态解吸曲线

Figure 9. Dynamic desorption curve

2.7 PCf纯化前后的黄酮和还原糖含量测定

经HPD-500大孔树脂纯化后，PCf总黄酮和还原糖含量的变化。纯化后的PCf的总黄酮含量显著增加（P<0.05）从48.49±0.91 mg RE/g DW增加到132.2±9.62 mgRE/g DW，提高了约3倍，与周红艳等提取纯化瓯柑果皮类黄酮纯度提高3.07倍的结果接近，王狄等利用超声提取并用大孔树脂分离纯化番茄渣的总黄酮，其总黄酮含量从7.35 mg/g提升至53.5 mg/g，相比较之下，陈皮总黄酮含量更高；其还原糖含量显著下降（P<0.05）从239.06±1.37 mg GE/g DW降低到6.36±0.07 mg GE/g DW，展示出良好的脱糖效果，纯化前后的含量表现出显著差异性。

2.8 纯化后PCf的红外光谱

利用傅里叶红外光谱对纯化后的PCf进行扫描，可以对PCf的化学键成分进行初步鉴定。如图10所示，在3407.1526 cm⁻¹处的吸收峰是黄酮类物质中酚羟基的伸缩振动峰，信号强说明羟基数目较多，在2028.815 cm⁻¹处的吸收峰是C-H的伸缩振动，在1639.1245 cm⁻¹处的吸收峰C=C的伸缩振动，属于黄酮醇。1000~1200 cm⁻¹的区域内为C-O伸缩产生的振动，黄酮苷通常显示出糖基与黄酮骨架之间的连接带来的特征振动。综上可知，纯化后的PCf具有黄酮基本骨架，初步鉴定纯化后的PCf属于黄酮类化合物。

图 10 纯化后PCf的红外光谱

Figure 10. Infrared spectra of purified PCf

2.9 抗氧化、降血糖活性评价

ABTS⁺自由基、DPPH自由基清除能力和铁离子还原能力来检验PCf的抗氧化效果，α-葡萄糖苷酶抑制率常用来表征体外降血糖活性，PCf的抗氧化和降血糖活性如图11所示。由图11可得，在0.1~0.5 mg/mL的浓度范围内，随着浓度的提升，PCf对ABTS⁺自由基和DPPH自由基的清除率也在增加。纯化后的PCf对ABTS⁺自由基的清除率比纯化前的PCf有大幅度提升，且在0.5 mg/mL的浓度与V_C差距较小，可达到93.75%±0.82%。纯化前后的IC₅₀值分别是0.18±0.01 mg/mL和0.10±0.01 mg/mL。纯化后的PCf明显比纯化前的PCf清除率更强。黄芪茎叶的总黄酮IC_{50 ABTS}值0.69 mg/mL和菜芙蓉花黄酮的IC_{50 ABTS}值0.018 mg/mL，PCf显示出更强的ABTS⁺自由基清除率。

图 11 PCf的抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶活性

Figure 11. Antioxidant and α-glucosidase inhibitory activities of PCf

注：A. ABTS⁺自由基清除活性；B. DPPH自由基清除活性；C. 铁离子还原能力；D. α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

在0.5 mg/mL的浓度时，纯化前的PCf对DPPH自由基清除率为53.04%±0.01%，沈晓静等提取的咖啡叶总黄酮对DPPH自由基的清除率在0.5 mg/mL的浓度下为59.44%，两者较为接近。张贵川等采用AB-8纯化后的大蓟总黄酮的IC_{50 DPPH}值为0.58 mg/mL，大于纯化后PCf的IC_{50 DPPH}为0.19±0.01 mg/mL，相比之下PCf有更好的效果。

利用吸光度来反映纯化前后PCf对铁离子还原能力，在0.1~0.5 mg/mL的浓度范围内，随着浓度的增加，纯化前后的PCf对铁离子的还原能力也逐渐增加，在0.5 mg/mL时纯化后PCf的还原力是纯化前的2倍，与青皮无花果对铁离子的还原能力相当。基于先前的报道，黄酮具有良好的抗氧化活性，本结果与之相符合。因此，椪柑陈皮的抗氧化活性具有一定的研究意义。

由图11D可以看出纯化后的PCf比纯化前的PCf对α-葡萄糖苷酶呈现出更强的抑制效果。在0.04~0.4 mg/mL的浓度范围内，陈皮总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制率随着浓度上升而上升，在0.4 mg/mL时，纯化后的总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到66.84%±0.67%，纯化前后的IC₅₀值分别为0.27±0.01 mg/mL和0.13±0.01 mg/mL，比黑青稞麸皮多酚的（IC₅₀ 0.52±0.03 mg/mL）的效果更好，表明PCf对α-葡萄糖苷酶是具有一定的抑制作用。

结论与展望

本研究发现HPD-500大孔树脂适合分离纯化PCf，准二级动力学模型R²值最高为0.9997，最能反映HPD-500对PCf的吸附过程。当pH为2，上样流速为4 mL/min，洗脱流速为3 mL/min，洗脱浓度乙醇浓度为80%，PCf含量最高，提高了约3倍，表明该工艺条件效果可行，可以用于富集PCf，同时可为后续开展椪柑陈皮总黄酮功能鉴定和结构解析等研究提供技术基础。

体外活性表明，纯化后的PCf对ABTS⁺、DPPH自由基清除能力，铁离子还原能力都有良好的效果，对于α-葡萄糖苷酶也具有抑制活性，结果表明PCf具有良好的抗氧化和降血糖应用潜力，可以为后续更加深入研究椪柑陈皮的活性提供理论依据，该研究可为椪柑陈皮的开发利用提供一定的参考价值。后续研究可以增加不同陈化年份的椪柑陈皮黄酮类化合物的变化以及生物活性，黄酮单体物质与活性之间的关系，探究椪柑陈皮的生物活性及增加其附加值。

引用本文：张嘉琼，刘晨星，曹艳，等. 椪柑陈皮总黄酮大孔树脂纯化工艺优化及其体外活性分析[J]. 食品工业科技，2026，47（2）：239−248. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025010149.

Citation: ZHANG Jiaqiong, LIU Chenxing, CAO Yan, et al. Optimization of Macroporous Resin Purification Process and in Vitro Activity Study of Total Flavonoids from Citrus reticulata cv. Ponkan Peel[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026, 47(2): 239−248. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2025010149.

通讯作者简介

张雪春，女，博士，教授，博士生导师，入选云南省“兴滇英才支持计划”青年人才，兼任云南八凯农业开发有限公司科技副总，现为中国林学会青年工作委员会委员，《中国农业科学》、《河南工业大学学报（自然科学版）》、《热带作物学报》青年编委，主要研究方向为植物蛋白的加工及其性质研究、药食两用植物资源开发利用。

（以上信息来自西南林业大学官网）

夏其乐，男，研究员，硕士生导师/博士后合作导师，浙江省农业科学院果品加工研究室主任；国家食药同源创新联盟理事、浙江食品学会理事，中国生物发酵产业协会食药物质专业委员会、浙江省食品添加剂与配料协会、浙江省饮料工业协会智库专家，浙江省首批“科技副总”、浙江省团队特派员首席专家；SCI/EI收录期刊、一级学报审稿人，国家自然科学基金函评专家。主要从事杨梅、柑橘、桑椹、黄精等浙江特色水果与食药同源植物精深加工以及副产物增值利用。主持项目包括国家自然科学基金、“十四五”“十三五”国家重点研发项目子课题、“十二五”公益性（农业）行业专项课题、浙江省三农九方等项目多项。作为主要成员，参加国家基金面上项目、现代农业（柑橘）产业技术体系岗位科学家项目、省重点研发项目等多项。第一作者或者通讯作者在Carbohydrate Polymers, Food Chemistry, LWT-Food Science and Technology, Food Chemistry:X, 农业工程学报、中国食品学报等发表论文多篇；主持成果获浙江省科技进步三等奖1项，作为主要完成人获省部级一二等奖、行业二等奖多项；获授权发明专利30余件，其中第一发明人6件，多件专利实现转化应用。

（以上信息来自网络）

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