Nature-纳米技术：用光“扣动”神经元“扳机”的全新分子

近日，意大利技术研究院突触神经科学中心主任Fabio Benfenati教授和同学院纳米科学与技术中心主任Guglielmo Lanzani教授等人合作设计制备了一种基于偶氮苯的两亲性有机光致变色分子，在神经元质膜上实现了由可见光辐照诱导的无热效应的膜应力变化而产生神经冲动。

该种光致变色分子在活体内具有长效性以及不产生热量的特点，在未来的神经科学及生物医药中具有很大的科研和应用潜力。

近年来随着神经科学领域的不断深入，对神经元活动的时空调制技术越来越重要。

通过对特定的单个或众多神经元在精确的时间和空间上激活或抑制，我们可以更好地认识和区分脑回路的结构和功能，其成果也将有助于医学上对神经和精神疾病的治疗。

由于光具有在时空上的精确性和无损的特点，相较于利用磁场或热效应，利用光对神经元活动进行调制的研究尤为瞩目。

在对神经元活动的光调制技术中，近年来广受关注的方法之一是光遗传学（Optogenetics），通过在神经元细胞中表达光遗传学工具蛋白来控制神经元的生理活动。

例如通过表达视紫红质通道蛋白-2（Channelrhodopsin-2，ChR2）来介导光照激活后的钙离子输入引起去极化从而实现对神经元活动的控制。

但是光遗传学技术涉及到转基因过程，其应用于临床的安全性和有效性都是有待评估的。

在光遗传学之外，对神经元活动的光控制也可以利用材料和化学的方法实现，这些方法不依赖于转基因过程，因此在临床应用如对视网膜感光能力的修复等方面具有广阔的前景。

材料方面的策略是使用具有光敏性质的有机物界面，令神经元附着在其上，当有机物受到光刺激时会产生电效应而影响细胞膜从而实现对神经元的调制。

但是这种方法往往需要一定强度的光照或红外光照射，其产生的热效应有对神经元造成伤害的风险。

化学方面的策略是使用具有光致变色效应（Photochromic）的有机分子，通过控制光照来改变分子结构，从而实现控制细胞膜上的离子通道或者膜本身的电学性质，以达到控制神经元活动的目的。

在光致变色分子中，偶氮苯（Azobenzene）结构广泛应用于各种需要光开关的生物化学研究中。

偶氮苯在紫外光照射下会从反式结构转变为顺式结构，而在可见光波段下会从顺式结构转变为反式结构。

利用这一特点，通过在偶氮苯结构的基础上修饰各种基团，可以实现多种应用，例如光控的药物输送、光控核苷酸或肽的折叠、光控离子通道蛋白等。

利用含偶氮苯结构的有机分子对神经元活动进行光调制，往往是利用其对离子通道蛋白的控制而实现的。

尽管在神经元的光调制的方法有上述所言的丰富发展，但是定位于细胞膜上而不直接影响离子通道且不产生热效应的对神经元活动的可见光调制方法在此之前未有报道。

（4）在活体中的安全性、有效性和长效性。

研究者进行了大量工作，包括Ziapin2的合成和物理化学性能表征，并使用其进行了丰富且系统化的体外实验以及活体实验以验证其功能，这些工作主要是以下5个方面：

如图1所示，Ziapin2的中心结构是具有光活性的4-4‘二氨基偶氮苯，其两侧分别连接疏水性的环己亚胺和末端连接亲水性吡啶盐的双取代烷基链，整体呈现为一个两亲性分子。

图1 Ziapin2在不同环境中的反式与顺式异构化过程示意图

在可见光的照射下，稳定的反式结构的Ziapin2会逐渐发生向顺式结构的光异构化；撤去光照后，顺式结构的Ziapin2在黑暗中会向反式结构转化。这一过程是Ziapin2可作为光开关的基础。

研究者首先用分子动力学的方法模拟了水分子环境下Ziapin2分子与脂质体膜的作用过程，发现其具有与膜的亲和性，并能够以偶氮苯端插入膜并向膜双层中心移动，直到吡啶盐端位于水与膜的界面（图2）。

图2 分子动力学模拟中的截图，

显示Ziapin2（反式）在连续的时间范围（I–IV）自发进入脂质体膜双层膜模型的过程

同时研究者通过实验在原代海马神经元上证明了Ziapin2分子在搭载到神经元上后，主要分布于神经元质膜的脂筏中。

研究者利用分子动力学模拟发现分别分布于质膜双分子层两侧的两个相对的反式Ziapin2分子会由于骨架间相互作用而形成二聚体，从而拉近邻近区域的磷脂产生该区域质膜凹陷，使得质膜表现为变薄（图3，左图）。

而顺式Ziapin2分子由于分子间的疏水偶氮苯端距离太远而无法二聚化，使得质膜相较于未添加Ziapin2时的厚度不变（图3，右图）。

研究者后续通过对搭载反式Ziapin2的脂质体的实验，验证了模拟中的这种厚度变化。

图3 分子动力学模拟中的截图，

显示反式（左）和顺式（右）两种情况下Ziapin2分子在脂质体膜双层模型中的分布与结合情况

由于质膜的厚度与电容成反比，质膜的变薄会导致电容的上升。研究者通过实验，证实了这一点。

在黑暗中对搭载反式Ziapin2的脂质体膜（图4左图）和细胞（图4右图）的电容测量结果均表明由于质膜的变薄导致了电容的上升。

图4 黑暗中搭载（红色点线）与不搭载（黑色点线）Ziapin2分子情况下，测得脂质体膜（左图）和Hek293细胞（右图）的电容在搭载ziapin2分子后升高

通过在原代海马神经元中的实验，研究者发现在将反式Ziapin2加载到神经元上后，黑暗中神经元的电容将会上升，在给予光刺激后，神经元电容迅速下降并同时发生超极化，随后发生程度相似的去极化（图5左图）。

这一光调控超极化与去极化的过程在加载Ziapin2七天后仍然可以发生（图5右图）。

图5 神经元不搭载（黑色线条）或搭载（红色线条和紫色线条（七天后测量））Ziapin2，在光刺激（浅蓝色竖线为光刺激）前后的神经元电位随时间的变化

同时研究者通过实验证明了这种过程是单纯由电容变化导致的电流引起的，而不受神经之间的连接或是离子通道的影响，并且超极化幅度与Ziapin2的脂筏聚集分布密切相关。

利用这一现象，研究者实现了对搭载Ziapin2的不同神经元的动作电位的有效光启动，从而产生光控的神经冲动，实现光调制。这一效果同样可以维持七天。

通过向鼠大脑的躯体感觉皮层注射Ziapin2并使用光刺激，研究者发现光刺激能引起注射Ziapin2部位的皮层反应，并且这种光控反应与体外实验一致可以维持七天(图6)。

并且Ziapin2不会引起手术以外的炎症反应。

图6 在不注射（黑色线）或注射（红色线）Ziapin2后1、4和7天分别测得的躯体感觉皮层由光刺激诱发的局部场电位幅度随时间变化的曲线

这一研究提出了一种可以对神经元进行光调制的全新的两亲性有机分子，其最为显著的特点是可以直接定位于质膜上，并由可见光引起神经冲动，且不产生热效应。

这种分子及其衍生物在未来神经科学的研究和相关的神经药物研发等领域都具有巨大的潜力。

该论文题目是 Neuronal firing modulation by a membrane-targeted photoswitch ，发表在 Nature Nanotechnology 。