LPR封面: 多功能扫描式激光影像传感技术于細胞应用

撰稿：龚朝阳（新加坡南洋理工大学 博士后）

激光发射显微镜 (laser emission microscopy) 是自2017年发展起来的一种新型影像传感技术。该技术由收集微腔激光器的发射激光形成的影像，实现对生物样品的高对比度、高灵敏度传感分析。现有激光影像技术大都针对物理参数进行测量，鲜有能够实现多种生物化学信号分析的激光影像传感技术。本文提出了一种基于液晶微球激光器的多功能激光影像传感平台，并演示了其在实现多种细胞分泌物无标记分析中的应用潜力。相关工作以“Multifunctional Laser Imaging of Cancer Cell Secretion with Hybrid Liquid Crystal Resonators”为题发表在Laser & Photonics Reviews上，并被选为2022-8月封面论文。

图1：多功能扫描式激光影像传感技术的论文封面图。

微腔生物激光器通过在微腔内部集成生物系统以实现高灵敏度的生物信息感知。因其在生物医学和生物学应用中表现出的巨大潜力，该领域在近几年得到了蓬勃发展。在微腔和增益介质共同作用下，腔内光和物质相互作用被显著增强。因此，微腔生物激光器表现出了极高的检测灵敏度，同时具备线宽窄、高信噪比、高对比度等显著特征。近年来新兴的激光影像传感技术整合了影像技术和微腔生物激光技术，可在实现高灵敏度生物探测的同时提供丰富的空间信息，目前已经在生物细胞、生物组织等分析中被广泛应用。但是，现有的技术手段还难以实现多功能的传感器并反映细胞-环境相互作用下的复杂信号，且必須依靠細胞染色。本文提出一种基于液晶微球激光器的多功能激光影像传感技术，演示了多种细胞分泌物的无标记分析 (label-free)，并研究了细胞对外界刺激的相应。

研究人员利用液晶微球和法布里-珀罗微腔（FP腔）构成的复合微腔结构实现生物激光器。如图2a所示，细胞附着于FP腔镜的底部，液晶微球分散于细胞周围。研究人员制备了三种液晶微球（直径~ 2 µm ），分别掺杂有不同染料可分别实现绿光、黄光、红光激光输出。液晶微球表面分别修饰硫氢基团（-SH）、捕获抗体和羧基（-COO^-）,可分别实现细胞氧化还原产物（ROS）、蛋白（Proteins）以及离子（Ions）的捕获和检测。目标待测物结合到液晶表面后，液晶排列发生改变。由于液晶分子的转动引入更多的腔内散射，输出的激光强度逐渐降低（如图2b所示）。通过扫描各个液晶微球出射的激光信号并检测其时域变化，可以反应细胞分泌物的实时变化规律（如图2c所示）。

图2.（a）基于多功能激光影像传感技术实现细胞分泌物分析示意图。(b)传感原理示意图。（c）从激光影像提取时域生物信号。

研究人员首先对微球-FP复合腔结构的激光输出进行表征。如图3a所示给出了三种不同颜色激光输出影像。由于微球的光场限制作用（如图3b所示），三种颜色的激光影像尺寸均被控制在1  µm以内（如图3c所示）。另外，该微球-FP复合腔结构还具备单纵模（如图3d、3e所示）、低阈值特性（如图3f、3g所示）。

图3.（a）不同染料掺杂液晶微球的激光影像。（b）微球-FP复合微腔内部光场仿真。（c）激光的空间分布。（d）激光光谱。（e）激光输出波长统计分析。（f）激光阈值。（g）激光阈值统计分析。

接着，研究人员以MIA PaCa-2细胞常见分泌物H₂O₂、Vimentin和NH₄⁺为例，演示了微球-FP复合微腔输出的激光信号对待测分子的响应情况。在按照如图2a所示的方式修饰上特异性基团或者捕获抗体后，三种颜色的激光输出分别对H₂O₂、Vimentin和NH₄⁺表现出高灵敏的响应。如图4a所示，在分别引入各自待测物分子后，三种颜色的激光信号均随时间显著衰减。如图4b给出了不同浓度的H₂O₂引起的激光强度时域变化。研究人员使用激光强度衰减为初始强度1/e²所对应的时间作为输出参量，分别对三种待测物的响应曲线进行标定（如图4c-4e所示）。

图4. （a）激光影像对待测物的动态响应。（b）不同H₂O₂浓度引起的激光强度时域变化。（c-e）不同浓度H₂O₂（a）、Vimentin（b）和NH₄⁺（c）的激光衰减时间。

进一步地，研究人员演示了细胞的蛋白分泌物对激光输出的影响。利用如图5a所示的激光扫描系统，可以一次性实现面积为416  µm  x 416  µm区域内的激光信号激发与收集。如图5b、5c所示，在FP腔镜底部附着细胞后，该结构依旧能够保持良好的激光输出性能。激光扫描系统可以一次性采集大量液晶微球的激光输出影像。如图5e-5h对比了不同细胞孵育时间的激光扫描影像。Vimentin与癌细胞生长、入侵等行为相关，并在MIA PaCa-2大量表达。随着细胞孵育时间的增加，细胞周围环境中的Vimentin浓度逐渐增加。因此，扫描激光影像的强度随着细胞孵育时间逐渐降低（如图5i所示）。

图5. （a）扫描系统示意图。（b）MIA PaCa-2细胞以及液晶微球明场影像。（c）液晶微球的激光影像。（d）扫描区域的明场影像。（e-h）细胞孵育0 h （e）、2 h （f）、4 h （g）、8 h（h）后的激光扫描影像。（i）扫描激光影像强度随孵育时间的变化趋势。

最后，研究人员演示了细胞对药物的响应。-lapachone（-lap）是一种广谱抗癌药，可扰乱癌细胞内的氧化还原过程并产生过量的H₂O₂积累，从而引起细胞死亡（如图6a所示）。如图6b-6c所示对比了-lap处理前后的细胞状态。研究人员采用如图2a中所示的绿色和红色的液晶微球分别用于检测药物处理后细胞环境中的H₂O₂和NH₄⁺变化。在引入-lap后，H₂O₂浓度逐渐积累并引起细胞死亡，同时NH₄⁺也被大量释放。实验中，研究人员发现绿色和红色激光强度均随时间逐渐降低，证实了细胞环境中H₂O₂（如图6d-6f所示）以及NH₄⁺ （如图6g-6i所示）浓度的逐渐升高。绿色（如图6j所示）、红色（如图6k所示）激光信号时域变化分别揭示了药物处理后细胞环境中H₂O₂和NH₄⁺的变化规律。然而，在没有药物处理时，H₂O₂和NH₄⁺浓度未显示出明显变化（如图6i所示）。

图6. （a）药物（-lap）对细胞的影响示意图。（b-c）MIA PaCa-2细胞在-lap处理前（b）和后（c）的相衬显微影像。（d-f）不同孵育时间下的绿色激光扫描影像。（g-i）不同孵育时间下的红色激光扫描影像。（j-k）绿色（j）和红色（k）激光扫描影像强度随时间的变化规律。（i）对造组（无药物处理）绿色和红色激光扫描影像的强度随时间的变化。

论文信息：

Laser Photonics Rev. 2022, 16, 8, 2100734

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/lpor.202100734