食品工业科技编辑部

2022-01-04

建立一种增强酶抑制法快速检测谷物中有机磷农药残留

—— 安特百科（北京）科技发展有限公司

王文珺研究员

研究背景

粮食中的农药残留，既来源于田间喷洒的农药，也来源于粮食储运过程中使用的化学药剂，此外，地下水及土壤的农药污染也会迁移到粮食中。有机磷类农药是目前粮食生产存储过程中广泛并大量使用的杀虫剂，其残留严重危害人、畜及环境安全。有机磷类农药具有种类多、毒性差异大、化学性质不稳定、检测难度大等特点，检测方法主要有气相色谱（Gas Chromatography，GC）、液相色谱（Liquid Chromatography，LC）、气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）、液相色谱-质谱联用（Liquid Chromatography- Mass Spectrometry，LC-MS）等大型仪器分析方法和酶抑制法（分光光度法）等。

胆碱酯酶是酶抑制法应用的基础，其灵敏度、特异性及稳定性直接影响了检测结果的准确度，因此选择合适的酶一直是酶抑制法研究的热点。人们常采用乙酰胆碱酯酶（acetylcholine esterase，AChE）作为催化酶，但硫代磷酸酯类农药对AChE催化水解功能的抑制效果较差，因此常因灵敏度低而出现漏检的情况。为提高有机磷的检出率，王文珺、桑华春团队对酶抑制法进行了改良，选择对有机磷农药抑制效果较好的丁酰胆碱酯酶（Butyrylcholinesterase，BChE）作为研究对象；使用氧化剂溴代琥珀酰亚胺作为增强剂，以提高检测灵敏度，实现对粮谷中有机磷农药的有效检测，以期为我国粮食质量安全监管提供有力的技术支撑。

1 研究结果

1.1提取溶剂的选择

样品的前处理是酶抑制反应的关键步骤，选择合适的提取溶剂，可以有效提取待测农药、避免提取过程中破坏待测物的化学结构或酶的活性。本研究通过对PBS、乙醇和乙酸乙酯提取有机磷农药的效果进行分析，得到的方法检测限如表1所示。一般来说，固定其他条件，检测限值越低说明提取效果越好，即使用的提取溶剂效果最佳。使用乙醇作为提取剂，不同农药的检测限的范围为0.2～8.1 mg/kg，明显低于使用PBS和乙酸乙酯的检测限：1.2～22.4和0.8～16.8 mg/kg，因此，在后续研究中使用乙醇作为提取剂。

1.2胆碱酯酶的选择

一般认为，有机磷类农药可与胆碱酯酶（ChE）酯解部位丝氨酸的羟基共价结合，形成了磷酰化胆碱酯酶，降低了ChE酶促水解底物的能力，从而达到了抑制酶活性的效果。本研究对ChE受有机磷农药抑制的效果进行分析，包括苍蝇头部提取的乙酰胆碱酯酶(AChE)和马血清提取的丁酰胆碱酯酶（BChE），BChE在结构上与AChE类似，但BChE对底物的特异性和抑制的敏感性与AChE不同。本研究根据粮食生产存储中使用农药的种类，在阴性粮食样本中添加不同浓度的常用有机磷农药。由表2可知，不同浓度的有机磷农药对BChE的抑制率范围是33.8%±2.5%~96.1%±1.4%，稳定性范围（变异系数）是1.5%~8.1%，而对应浓度的有机磷农药对AChE的抑制率范围是15.7%±2.2%~67.9%±4.3%，稳定性范围是6.3%~14.2%。显然，有机磷农药对BChE的抑制率和稳定性都明显优于AChE，所以在后续研究中使用BChE作为水解酶。

1.3增强剂对硫代磷酸脂类农药抑制效果

增强剂在酶抑制法中起到了强氧化剂的作用，最初人们利用氯化物的氧化性作为增强剂，但现在趋向使用安全性较高的溴化物作为增强剂。硫代磷酸脂类农药经增强剂氧化后，其中的P=S基团变成了对胆碱酯酶敏感的P=O基团，提高了对酶的抑制效果。如表3所示，使用溴代琥珀酰亚胺作为增强剂，能明显改善硫代磷酸脂类农药对BChE的抑制，提高了检测的灵敏度。灵敏度是酶活性被50%抑制（IC50）时标准溶液中农药的浓度。

1.4标准抑制曲线的建立

根据GB/T 5009.199-2003，当被测样品的抑制率≥50%时，可判断为阳性[10]。如图1和表4，在优化条件下，对硫磷、辛硫磷、毒死蜱和三唑磷对马血清BChE的抑制中浓度IC50（50%抑制时，有机磷农药的浓度）分别为0.01、0.11、0.16和0.03 μg/L，低于相关报道的检测限值，标准抑制曲线由Origin分析软件得到，决定系数（R2）＞0.98，基本满足了谷物中农药残留的国家安全限量。曾有人提出参考竞争性酶联免疫，把农药残留的检测限定为IC20，以弥补酶抑制法灵敏度的不足，这一想法已在立项的粮食行业标准（LS）中得到贯彻。但在本实验中，因为使用了增强剂及选择了敏感的胆碱酯酶，IC50作为检测限已基本满足了检测要求，而且使用IC50作为检测限更稳定。

1.5粮食中有机磷农药残留检测

对北京地区不同来源的200个粮食样品进行检测，每个样品设置三个重复，检测结果与气相色谱进行比对。其中12个样本经气相色谱确证为阳性，186个样品两种检测方法都为阴性。粮食的基质比较简单，基本不含对酶有抑制作用的活性物质，由此产生假阳性的几率相对较低；但酶抑制法检测的是有机磷和氨基甲酸酯类的总量，得到的是多种农药残留的总量，如果种植和存储过程中使用了多种农药，则可能出现假阳性（如样本S76），因此，酶抑制法更适合受检样品只施用了某一种农药的情况。此外，对于少数农药来说，酶抑制法的检测限没有达到GB 2763-2019的限量要求，因此会导致假阴性的结果。比如本研究中，水胺硫磷的检测限是0.1 mg/kg，而国家安全限量0.05 mg/kg，在0.05~0.1mg/kg范围内，检测结果容易出现假阴性（如样本S234）。由表5可见，酶抑制法检测的200份样品中，187份为阴性，13份为阳性；按照《GB/T 5009.20-2003食品中有机磷农药残留量的测定》推荐的气相色谱法检，测结果为187份为阴性，13份为阳性。两种检测方法的阴性符合率为99%，阳性符合率为85%。总体样本符合率98%，较以前的研究报道有了很大的进步；同时说明北京地区粮食农药残留污染情况远低于全国平均水平。

2 结论

于2019年8月颁布的GB 2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》，规定了483种农药在356类食品中7107个残留限量，基本涵盖了我国已批准使用的常用农药和居民日常消费的主要农产品，其中谷物及其产品占据1/4 强。建立有效检测粮食中有机磷类农药残留快检方法，对于粮食质量安全的管控具有重要的意义。硫代磷酸酯类农药，具有最大残留限量低，对乙酰胆碱酯酶不敏感的特点，常规酶抑制法的检出限往往达不到国家安全限量要求，甚至根本无法检出。本研究通过选择合适的样品提取体系、使用增强剂、选择对有机磷类农药敏感的丁酰胆碱酯酶等，提高了检测灵敏度，实现了对有机磷农药残留的有效、快速检测，最大程度避免了漏检。但本研究改良的方法依然无法满足全部有机磷农药的检测限要求，导致产生假阴性，后续还需要进一步优化条件，提高检出率。

作者简介

王文珺

研究员

王文珺，女，博士，研究员，就职于安特百科（北京）科技发展有限公司，湖南工业大学客座教授。硕士和博士分别毕业于中国农业大学园艺学院和资源与环境学院。清华大学化学系博士后出站。多年来一直从事免疫检测技术的基础及应用研究工作，对快速检测技术有深厚的积累和见解。发表学术论文50余篇，其中SCI论文16篇，获得授权国家专利11项，主编专著一部，参编译著两部，主持或作为技术骨干参与“十二五”国家科技支撑计划、“十三五”国家科技支撑计划等国家及省部级重点项目多项。2018年，作为第一完成人获得“长城食品安全科学技术奖”一等奖。

代表性论文：

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