崔心禹 硕士研究生
沈建福 教授
研究背景
5α-还原酶（5α-Reductase, 5α-R）是重要的雄性激素代谢酶，睾酮（Testosterone, T）在5α-还原酶（5α[1]R）的作用下不可逆地转化双氢睾酮（Dihydrotesto[1]sterone, DHT），过程中还要依赖还原性辅酶II（NADPH），如图1所示。DHT是最强的活性雄性激素，因为它与雄性激素受体（Androgen receptor, AR）的亲和性比T高2~5倍，诱导AR信号传导的效力比T高10倍可引发雄性激素依赖性疾病比如痤疮、雄激素源性脱发、女性多毛症、前列腺癌、前列腺增生、假两性畸形等。
5α-R是皮肤中最重要的雄性激素代谢酶，它具有三种同工酶，其中I型和II型酶的特征比较清楚，二者的主要区别为5α-RI主要存在于肝脏及非生殖器官皮肤，其发挥生理作用的最适pH为范围较宽为6~9，而5α-RII主要存在前列腺、睾丸、附睾、精囊、头皮毛囊等，其最适pH为5.5。
目前已开发的5α-R抑制剂包括甾体类和非甾体类，最常见药物如非那雄胺、度他雄胺、爱普列特等。但这些药物存在不良反应，如代表性药物非那雄胺可能对男性造成抑郁、焦虑、认知障碍、勃起障碍、性欲减退、男性乳房女子化、肌肉生长受损等副作用，统称为非那雄胺后综合征（Post-finasteride syndrome, PFS）。这些副作用是这类药物本身固有的，难以通过改造结构来消除，因此从天然植物中寻找安全、有效且来源广泛的5α-R抑制剂替代这些化学合成的抑制剂已成为国内外研究的热点。Niederprüm等通过体外实验证实了锯叶棕果实提取物具有5α-R抑制活性以及治疗前列腺增生的效果。Weisser等发现锯叶棕提取物IDS 89对人前列腺上皮和间质中的5α-R具有抑制作用，且属于非竞争性抑制，有效成分是可皂化亚组分中的月桂酸，它对上皮和基质的最大抑制率分别为52%和45%。邓桂球等从雌性大鼠肝脏、雄性大鼠附睾组织中分别提取I型、Ⅱ型5α-R，采用HPLC法测定出红花提取物对I型、Ⅱ型5α-R活性均有抑制效果，抑制率分别达到88.12%和61.65%。另外也有研究报道大黄、非洲臀果木、大荨麻、薰衣草、莲子心等植物的提取物具有良好的5α-R抑制活性，是天然来源的5α-R抑制剂。
油茶叶是山茶科植物油茶Camellia oleifera的叶，《中华本草》中提到其味微苦，性平，有治疗鼻衄，皮肤溃烂瘙痒，疮疽的功效。罗晓伟等已经证明油茶蒲具有5α-R抑制活性，油茶叶与油茶蒲同为油茶的重要组成部分，推测油茶叶与油茶蒲可能具有类似的生物活性。沈建福团队以5α-R为研究靶点，旨在探究油茶叶提取物对5α-R活性的影响，探讨其成为潜在的5α-R抑制剂的可能性，并分析其化学成分，为其在治疗雄性激素依赖型疾病如痤疮、前列腺癌等提供理论依据。
1 5α-R粗酶提取物蛋白含量的测定
粗酶提取物呈现粉红色，采用Bradford法对5α-R粗酶提取物定量，以蛋白质含量表示。测得蛋白质含量的标准曲线为y=0.5753x+0.5269（y为吸光值，x为标准蛋白浓度，R2=0.9977），计算得出蛋白质浓度为12.12 mg/mL。
2 T的标准曲线
如图2所示，T在5~2000 μmol/L范围内呈现良好的线性关系 ，回归方程为y=18110x+116886（R2=0.9998）。
3 酶促反应体系的确定
如图3所示，在0.5~2.5 mmol/L范围内，随着NADPH浓度的增加，酶活性不断上升，当NADPH浓度为2 mmol/L时再增加时对酶活性的影响不大，而且考虑到NADPH价格昂贵，故最终选择2 mmol/L作为NADPH在5α-R酶促反应体系中的适宜添加浓度。如图4所示，在0.1~2 mmol/L范围内，随着T浓度的增加，酶活性不断上升，选择酶活性最高时对应的2 mmol/L作为T在5α-R酶促反应体系中的适宜添加浓度。如图5所示，5α-R提取物浓度在0.38~0.76 mg/mL范围时，随着提取物浓度增加，酶活力逐渐上升，在浓度为0.76 mg/mL时达到最高值，之后随着提取物浓度的增大酶活力反而降低，因此确定0.76 mg/mL为粗酶提取物浓度在5α-R酶促反应体系中的适宜添加浓度。
最终确定的反应条件如下：pH为7.4的磷酸盐缓冲液300 μL，添加浓度为0.76 mg/mL的粗酶提取物500 μL，添加浓度为2 mmol/L的T 50 μL，样品50 μL,添加浓度为2 mmol/L的NADPH 100 μL，反应温度为37 ℃，反应时间为30 min。
4 酶促反应体系的稳定性
根据2.3确定的反应条件，分别测定四份空白对照管和酶正常反应管（同一批次）酶活性分别为(6.11±0.16)、(565.53±9.24) μmol T/（g prot·30 min），相对偏差均小于2%，说明该法可重复，此5α-R酶促反应体系稳定强。
5 度他雄胺的5α-R抑制活性
如图6所示，当度他雄胺浓度范围为2~16 nmol/L时，阳性药物度他雄胺对5α-R的抑制作用具有量效关系，曲线拟合度良好，根据拟合曲线算得度他雄胺对5α-R的半抑制浓度（IC50）为6.24 nmol/L，有文献报道度他雄胺对I型5α-R的IC50等于6 nmol/L，与本测定值相近，进一步说明5α-R酶促反应体系可靠有效。
6 不同油茶叶提取物得率
不同极性溶剂的油茶叶提取物的得率如表1所示，50%乙醇、甲醇、乙醇、正丁醇油茶叶提取物的得率高均超过20%，其中油茶叶50%乙醇提取物的得率最高达29.02%。这是因为该溶剂的溶解范围广，可以富集大多数的活性成分。
7 油茶叶不同溶剂提取物的5α-R抑制率
根据图7可知，200 μg/mL的油茶叶提取物对5α-R的抑制活性有影响，油茶叶石油醚提取物对其有促进作用，而其他油茶叶提取物呈现不同程度的抑制作用，其中油茶叶50%乙醇提取物对5α-R抑制效果最明显，高达49.77%±4.43%，其次，二氯甲烷提取物和甲醇提取物对5α-R的抑制活性也较高，分别为41.26%±0.02%、36.66%±0.71%。由于油茶叶50%乙醇提取物5α-R抑制率最高，因此最佳制备溶剂为50%乙醇，并将其提取物命名为COLE（Camellia oleifera Leaves Extract, COLE），测得其IC50为259.56 μg/mL。已知临床上使用度他雄胺的治疗剂量为0.5 mg/d，经过等效换算，若以5α-R抑制活性为指标，39.35 mg/d COLE与度他雄胺临床剂量治疗效果相当。
8 油茶叶提取物的总酚和总黄酮含量及与5α-R抑制率的相关性分析
A1~A8的总酚、总黄酮含量见表2。Pearson相关性分析如表3所示，A1~A8中总酚、总黄酮含量与5α-R抑制率相关系数分别为0.609和0.808，即5α-R抑制率与油茶叶提取物中总多酚含量在高度正相关（r>0.6），5α-R抑制率与总黄酮含量存在显著的强正相关（r>0.8，P<0.05），这表明油茶叶提取物中的多酚与黄酮是抑制5α-R的重要物质。
9 油茶叶提取物的化学成分分析
由上述结果可知油茶叶提取物中的多酚与黄酮可能是抑制5α-R的重要物质基础，采用UPLC[1]Triple TOF-MS/MS对COLE中的酚类化合物进行定性分析，结果在COLE中共发现22种酚类化合物。图8为负离子模式下的总离子图，表4为COLE中酚类化合物鉴定结果。Richard等研究证明芦丁（IC50>100 μmol/L）、槲皮素（IC50=23 μmol/L）具有I型5α-R抑制活性。另外还发现儿茶素等茶多酚类物质，在无细胞状态下显示出有效的5α-R抑制作用，但在5α-R的全细胞分析中抑制作用不明显。周琛媛等在具有高5α-R抑制活性的油茶蒲聚酰胺组Fr8中分离纯化（采用固相萃取的方式），通过质谱和核磁共振的手段进行结构鉴定出F1为3-O-没食子酰基-4,6,-[（S）-六羟基联苯二酰基]-α/β-D-吡喃葡萄糖（Gemin D），F4为3,4,6-三-O-没食子酰基[1]α/β-D-吡喃葡萄糖（GAG）。这些物质均在COLE中被发现，它们是COLE发挥5α-R抑制活性的物质基础。
结论
本研究以5α-R为研究靶点建立酶促反应体系，通过确定粗酶提取物、NADPH、T的适宜添加浓度优化该体系，确定反应体系如下：PBS缓冲液（pH7.4）300 μL，0.76 mg/mL的粗酶提取物500 μL，2 mmol/L的T 50 μL，样品50 μL，2 mmol/L的NADPH 100 μL，37 ℃下反应30 min。按照该体系用HPLC法测量临床上使用的I型5α-R抑制剂度他雄胺的5α-R抑制活性，结果测得其IC50为6.24 nmol/L，证实该法可靠有效。通过重复性试验证实该反应体系具有稳定性。然后用该法进一步测定、比较不同油茶叶提取物5α-R抑制活性，其中50%乙醇油茶叶提取物的5α-R抑制活性最高（IC50=259.56 μg/mL），证明50%乙醇油茶叶提取物是潜在的植物来源的5α-R抑制剂。最后采用UPLC-Triple TOF-MS/MS对油茶叶提取物中的化学成分进行了分析鉴定，结果共发现22种酚类化合物，其中槲皮素、芦丁、儿茶素、3-O[1]没食子酰基-4,6,-[（S）-六羟基联苯二酰基]-α/β-D-吡喃葡萄糖（Gemin D），3,4,6-三-O-没食子酰基-α/β-D[1]吡喃葡萄糖可能是COLE发挥5α-R抑制活性的物质基础。因此本研究证明了油茶叶提取物是天然的5α-R抑制剂，在治疗雄性激素依赖型疾病方面具有良好的应用前景。
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