唐金鑫 硕士研究生
毕云枫 教 授
研究背景
花生粕是饲料、肥料和酿造的原料，是花生油提取后的副产品。花生粕的蛋白质含量约为40%~50%，包含8种必需氨基酸，但花生蛋白质中的赖氨酸和蛋氨酸含量相对不足。与大豆蛋白相比，花生粕蛋白更易于吸收且抗营养因子较低。花生粕蛋白的酶促水解不仅可以充分利用花生粕中的蛋白质，而且还可以产生具有生物活性的小肽，解决了花生蛋白必需氨基酸不足的缺陷。已有研究描述了食物来源的短链生物活性肽，其残基范围为2~20个氨基酸。除了基本营养外，还具有类似激素的生理功能。这些肽可能具有多种药理或生理作用，包括抗氧化剂、抗糖尿病药和降低血压，具体取决于氨基酸的组成及其序列。Liu等从花生蛋白分离物中分离出一种血管紧张素转化酶（angiotensin conver[1]ting enzyme，ACE）抑制肽，其氨基酸序列为Cys-Val[1]Thr-Pro-Ala-Leu-Arg。Ye和Ng从花生中分离出一种新型的抗真菌肽，其序列与花生过敏原Ara H1相似。在人肠中对氨基酸的吸收很差，但是分子量小于1000 Da的寡肽很容易被吸收。
食物来源的生物活性肽在药理活性方面被广泛研究。具有特定氨基酸序列的肽在减少和维持饮食相关疾病（例如糖尿病（diabetes，DM））的发作方面具有特别重要的意义。DM是一种复杂的代谢综合症，由生产减少、生物利用度不足和胰岛素对血浆葡萄糖水平升高的敏感性差引起。在复杂的碳水化合物进一步转化成更简单的形式（葡萄糖）并吸收到血液系统之前，α-淀粉酶起着引发化学分解的基本作用。研究表明，在饮食混合碳水化合物后，抑制α[1]淀粉酶可以大大降低餐后血糖水平的升高。因此为控制II型糖尿病，具有α-淀粉酶抑制潜能的功能性食品和营养保健品得到了广泛认可。毕云枫团队将花生粕提取蛋白进行酶解，以α-淀粉酶抑制率和多肽得率为评价指标，筛选出最佳蛋白酶，通过酶解条件优化实验获得最佳酶解工艺条件，获得α-淀粉酶抑制肽。
1 蛋白酶筛选结果
由图1可知，五种蛋白酶的多肽得率都超过了30%，对α-淀粉酶也有一定的抑制效果，说明五种酶对花生多肽都有一定得酶解效果，其中风味蛋白酶无论是在α-淀粉酶抑制率还是多肽得率，都表现出不错的结果。碱性蛋白酶和中性蛋白酶的多肽得率也表现出不错的效果，但其α-淀粉酶抑制率低于风味蛋白酶，考虑可能是由于蛋白酶解程度越大，多肽得率越高，生成的小分子肽段越多导致具有抑制活性的肽段越少，因此，选择风味蛋白酶进行后续实验。
2 单因素实验结果
2.1 料液比对蛋白酶解液的影响
由图2可知，酶添加量一定时，多肽得率随液料比的增大而降低，这是因为底物浓度越低，其与酶结合的几率就越低，多肽得率也越低。α-淀粉酶活性抑制率呈现先上升后下降的趋势，在液料比为20:1 mL/g时α-淀粉酶活性抑制率最高为42.19%。因此风味蛋白酶制备花生粕多肽的最佳料液比为20:1 mL/g。
2.2 超声功率对蛋白酶解液的影响
超声波预处理能破坏花生蛋白的结构，使酶的结合位点增多，更容易使花生蛋白酶解为小分子肽段。由图3可知，多肽得率和α-淀粉酶抑制率都随超声功率的增大呈现先上升后下降的趋势，当超声功率为150 W时，α-淀粉酶活性抑制率为最大值36.7%，但当超声功率继续升高时，花生蛋白结构被破坏，酶结合位点持续增多，大分子蛋白被酶解为更小的分子量的短肽，导致α-淀粉酶抑制率降低。因此风味蛋白酶制备花生粕多肽的最佳超声功率为150 W。
2.3 超声时间对蛋白酶解液的影响
2.4 酶添加量对蛋白酶解液的影响
由图5可知，随着酶添加量的增大，蛋白液不断被酶解解，多肽得率随之上升，α-淀粉酶抑制率先上升后下降，增大酶添加量使其与底物充分接触，大分子蛋白质被水解成不同分子量的肽段，α-淀粉酶抑制率出现降低。当酶添加量为5000 U/g时，α-淀粉酶活性抑制率达到最大值为51.62%。因此风味蛋白酶制备花生粕多肽的最佳酶添加量为5000 U/g。
2.5 酶解时间对蛋白酶解液的影响
3 响应面优化试验设计及结果
采用Design-Expert．V8.0.6统计软件设计，响应面优化试验结果见表3，回归方差分析见表4。
采用Design-Expert.V8.0.6统计软件 ，对表3中的试验数据进行二次多项式回归拟合，最终获得二次项回归方程为：
α-淀粉酶抑制率Y=+55.88+1.26A−0.0.56B+3.48C+0.13AB−1.18AC+0.67BC−1.87A2−2.58B2−7.96C2。
从表4可以看出，该模型P<0.0001，差异极显著，因变量与所考察的自变量之间线性关系显著R2=0.9306，模型调整确定系数R2 Adj=0.9846，说明该模型可信度较高，拟合度较好。失拟项不显著P=0.2489>0.05，说明本实验所得二次回归方程能够很好对响应值进行预测。从方差分析结果可以看出各因素对ɑ-淀粉酶抑制率的影响力大小的顺序为：C>A>B，即酶添加量>液料比>超声时间。
4 响应面分析及最优条件确定
通过回归方程绘制花生粕多肽酶解工艺条件的响应面分析图，响应面图呈开口向下的凹形曲面，表明ɑ-淀粉酶抑制率存在极大值，由等高线的中心位置可以表明ɑ-淀粉酶抑制率的最优条件存在于设计因素水平的范围之内。响应面交互作用受曲面坡度的影响，曲面陡表明该因素对ɑ-淀粉酶抑制率的影响显著，曲面平缓表明该因素ɑ-淀粉酶抑制率的影响不显著；等高线形状反映两因素交互作用的强弱，椭圆形表明两因素交互作用强，圆形则表明两因素交互作用弱；等高线密集表明对ɑ-淀粉酶抑制率的影响较大，稀疏表明对ɑ-淀粉酶抑制率的影响较小，结果如图7所示。
通过Design-Expert 8.0.6软件优化得到花生蛋白制备α-淀粉酶抑制肽的最佳工艺条件：液料比为21.35 mL/g，超声时间为29.25 min，酶添加量为5195.75 U/g，在此试验下，α-淀粉酶抑制率为51.4112%。采用这一结果并根据实际情况，将工艺条件改为：液料比为20:1 mL/g，超声时间为30 min，酶添加量为5000 U/g，得到实验结果为50.62%。与理论值较为接近，说明经过响应面优化得到的超声波辅助酶解花生蛋白制备α-淀粉酶抑制肽工艺参数具有较高可靠性。
5 超滤分离纯化花生粕多肽的结果
花生蛋白酶解液经超滤分级分离后得到分子量不同的四个组分，取样品浓度为5 mg/mL分别测定各个多肽组分对ɑ-淀粉酶的抑制率，结果如表5所示。
由表5可知，不同分子量组分的ɑ-淀粉酶抑制活性不同。ɑ-淀粉酶抑制活性随着分子量的降低而显著增加。当花生粕多肽分子量<3 kDa时，其对ɑ-淀粉酶抑制率最高。Gu X从榨油后的杏仁残渣中提取的两种降血糖肽，肽A肽B的分子量分别为341.37和291.31。Yuwen Fang从丝胶中提取纯化鉴定出的降血糖肽的分子量为632、689、774 kDa。由此可以看出，超滤后具有较高活性的肽段分子量都比较小，因此选择分子量<3 kDa 的组分进一步纯化。
6 Sephadex G-15凝胶分离纯化结果
将分子量<3 kDa的多肽组分进行Sephadex G[1]15凝胶纯化，得到三个组分峰（P1、P2、P3），结果见图8，由图可知，P3为主要组分峰。分别收集各个组分峰，−20 ℃冷冻干燥，测定各组分峰对α-淀粉酶抑制率。结果见图9。
将收集后的3个组分峰多肽，配制成1 mg/mL浓度相同的溶液，分别测其对ɑ-淀粉酶的抑制率。由图9可知，P1、P2、P3三个组分的抑制率分别为63.08%、57.56%、73.30%。P3组分多肽明显高于其他组分。凝胶过滤层析中，大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，较大分子化合物后洗脱出来，由此可以推测，三个组分的分子质量大小为P1>P2>P3。
7 结论
本实验以花生粕为原料提取花生蛋白，经过超声波预处理后酶解花生蛋白获得粗肽，以多肽得率和α-淀粉酶抑制率为指标筛选最适蛋白酶，在单因素实验上，选取液料比、超声时间、酶添加量进行Box-Behnken 试验设计，得到最优工艺条件为：液料比为20:1 mL/g，超声时间为30 min，酶添加量为5000 U/g，在此条件下，α-淀粉酶抑制率为50.62%。与未经过超声处理组的α-淀粉酶抑制率35.45%相比，有显著提升，为继续提高多肽的抑制活性，对粗肽进行分离纯化。经超滤分级分离，得到四个不同组分，分别为>10 kDa、5~10 kDa、3~5 kDa、<3 kDa><3 kDa，其中<3 kDa分子量抑制率达到最高60.21%。利用Sephadex G-15凝胶分离纯化<3 kDa组分，得到P1、P2、P3三个组份，其中P3最高抑制率可达到73.30%。由此可见，花生多肽对ɑ-淀粉酶抑制率效果显著，当然如果想要继续提高抑制率，还需对酶解液进一步纯化处理。
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