​渤海大学仪淑敏教授等|大豆分离蛋白与金线鱼肌球蛋白的相互作用对其凝胶特性的影响

01

SPI添加量对金线鱼肌球蛋白-SPI混合溶液平均粒径的影响

粒径是蛋白质聚集体大小的宏观表现。当蛋白质发生变性、聚集时，粒径就会增大。如图1所示，所有试验组的粒径均高于对照组，并且随着SPI添加量的增加粒径逐渐变大。这是因为SPI与金线鱼肌球蛋白发生相互作用，诱导金线鱼肌球蛋白结构发生变化，暴露出更多的疏水基团，蛋白分子通过疏水相互作用、静电相互作用等聚集成簇，使粒径增大。Niu等发现SPI和和肌肉蛋白之间主要通过疏水相互作用、氢键和二硫键产生相互作用，且经过温和加热结合酸处理后的SPI与肌肉蛋白间产生了更强的相互作用。在2%~4%的添加量范围内，粒径增量较大，添加量超过4%以后，粒径增量变小，表明4%添加量时，SPI、金线鱼肌球蛋白间的结合近似饱和。

02

SPI添加量对金线鱼肌球蛋白-SPI混合溶液总巯基含量的影响

蛋白分子的巯基含量变化趋势在一定程度上表征蛋白三级结构和二硫键的变化。由图2可知，未加热条件下随着SPI添加量的增加，混合溶液的总巯基含量呈现先显著增加后显著减少的趋势（P<0.05）。这可能是因为适量的SPI使金线鱼肌球蛋白三级结构发生变化、蛋白分子变性展开，暴露出更多的活性巯基和隐藏巯基；添加过量的SPI又可能将暴露出来的活性巯基和隐藏巯基再次包埋或覆盖，从而使总巯基含量呈现减少趋势。Du等研究发现热处理（> 40℃）导致蛋白质结构的展开，原来位于内部的巯基暴露、交联形成二硫键。在SPI添加量4%时混合溶液的总巯基含量最高，表明添加4% SPI组样品加热后易形成更多的二硫键，这有助于凝胶特性的改善。

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SPI添加量对金线鱼肌球蛋白-SPI混合溶液紫外光谱的影响

紫外光谱是表征蛋白质三级结构的一种常用方法，大多数蛋白质由于色氨酸和酪氨酸残基对光的吸收在280 nm附近存在吸收峰。由图3可知，混合溶液有一个紫外吸收峰，波长在275 nm左右，该峰峰值的变化与芳香族氨基酸的暴露有关。随着SPI添加量的增加，混合溶液紫外吸收峰值呈现出先上升后下降最后上升的趋势，且SPI添加组的吸光度均高于对照组。表明随着SPI添加量的增加，蛋白之间发生不同程度的交联，蛋白质结构展开，埋藏在内部的发色基团有不同程度的暴露，导致特征峰值有不同程度的升高。其中4%和8%的SPI添加量时峰值较高，说明4%和8%的SPI添加量下蛋白结构展开的程度较高，更多的发色基团暴露在环境中。此外，6%的SPI添加量时吸光度的下降可能是由于形成了高分子量聚合物，导致一些非极性芳香氨基酸残基被部分掩盖；8%的SPI添加量时吸光度上升的原因可能是添加的过量的SPI本身所含有的芳香族氨基酸的引入以及蛋白的交联共同作用的结果。

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SPI添加量对金线鱼肌球蛋白-SPI混合溶液内源荧光光谱的影响

内源荧光强度通常用于通过估计受荧光能量影响的芳香族氨基酸残基（主要是色氨酸）的变化来确定蛋白三级结构的变化。由图4可知，添加SPI后，混合溶液的荧光强度均低于对照组，出现荧光猝灭现象。表明SPI与金线鱼肌球蛋白的混合使金线鱼肌球蛋白三级结构发生变化，位于蛋白质内部的芳香族氨基酸分子的侧链基团暴露，金线鱼肌球蛋白分子中色氨酸或酪氨酸残基的微环境发生了改变。此外，随着SPI添加量的增加，混合溶液的荧光强度呈现先下降后上升最后下降的趋势，4% SPI组的内源荧光强度最低，表明4%的SPI与金线鱼肌球蛋白相互作用时，更接近于位于蛋白疏水空腔内自发荧光的氨基酸残基。SPI添加量低于4%时荧光猝灭的主要原因可能是适量的SPI诱导金线鱼肌球蛋白结构展开，暴露出更多的内部芳香族氨基酸残基；6%的SPI添加量时荧光强度的上升可能是由于形成了高分子量聚合物，导致一些非极性芳香氨基酸残基被掩盖；8%的SPI添加量时荧光强度再次下降的原因可能是添加过量的SPI本身所含有的芳香族氨基酸残基的暴露和金线鱼肌球蛋白暴露出的芳香族氨基酸残基共同作用的结果。荧光光谱（图4）与紫外光谱（图3）的结果一致，均证明了SPI的添加使金线鱼肌球蛋白三级结构发生改变，进而影响氨基酸残基的微环境。

05

SPI添加量对金线鱼肌球蛋白凝胶强度的影响

由图5可知，在8%的SPI添加量范围内，金线鱼肌球蛋白凝胶强度随着SPI添加量的增加呈现出先上升后下降的趋势，添加4% SPI组样品的凝胶强度最高（1255.253 g·mm），与对照组（1155.161 g·mm）相比，凝胶强度增加了8.66%。表明适量的SPI能显著提高金线鱼肌球蛋白凝胶强度，原因可能是SPI的填充效应使金线鱼肌球蛋白凝胶的网状结构更加紧密，而过多的SPI对金线鱼肌球蛋白的稀释效应或添加过量的SPI可能会阻碍金线鱼肌球蛋白的交联导致混合蛋白整体的凝胶性下降。邓立青等研究发现添加3%的SPI时铜盘鱼鱼糜的凝胶强度最好、崔旭海等研究发现添加适量的外源性蛋白可以提高鲤鱼鱼糜的凝胶强度，和本文的研究结果相似。此外，凝胶强度的变化趋势和图2总巯基含量的变化趋势一致，证实了巯基氧化形成二硫键有利于凝胶特性的改善。

06

SPI添加量对金线鱼肌球蛋白凝胶质构特性的影响

如表1所示，0%~4%的SPI添加量范围内，金线鱼肌球蛋白凝胶的硬度随着SPI添加量的增加而逐渐上升，4% SPI添加量时硬度达到最大值569.70 g，之后逐渐下降。与对照组相比，弹性、粘聚性、胶着度、咀嚼度和回复性都呈现出先上升后下降最后略微上升的趋势，于4% SPI添加量时达到最大值。4% SPI添加量之前，质构特性改善的原因可能是SPI对金线鱼肌球蛋白凝胶网络的填充作用和其本身作为内源酶抑制剂能够抑制霉变、改善质构的作用；4% SPI添加量之后，质构特性下降的原因可能是过量SPI的添加对金线鱼肌球蛋白产生了较强的稀释作用、阻碍了金线鱼肌球蛋白的交联，而8% SPI添加量时金线鱼肌球蛋白凝胶的质构特性又略微得到改善的原因可能是过量的SPI对水分的吸收和加热后形成的SPI聚集体对金线鱼肌球蛋白凝胶基质的强化效应大于SPI对金线鱼肌球蛋白的稀释作用。综上，SPI添加量为4%时，金线鱼肌球蛋白凝胶的质构特性最好，与凝胶强度的结果一致。

07

SPI添加量对金线鱼肌球蛋白动态流变学性质的影响

储能模量（G'）表示样品的弹性趋势，损耗模量（G''）表示样品的粘性趋势。如图6所示，对照组的G'在38.65 ℃时达到峰值323.952 Pa，表明金线鱼肌球蛋白头部变性形成弹性凝胶网络，50.90 ℃之后随着温度的升高G'缓慢增加，添加SPI组样品的G'变化趋势与对照组基本一致。G''与G'的变化趋势相似，加热过程中，G'值大于G''值，表明金线鱼肌球蛋白形成了弹性凝胶。随着SPI添加量的增加，G'值与G''值都呈先增加后减少最后增加的趋势，且都高于对照组，这可能是由于加热增强了SPI与金线鱼肌球蛋白的变性和交联，形成了高弹性的凝胶网络结构。0%~4%的SPI的添加能结合自由水，填充金线鱼肌球蛋白凝胶网络，从而强化了金线鱼肌球蛋白凝胶基质，使蛋白分子间的相互作用增强；4%添加量之后，G'值与G''值下降的原因可能是过量SPI的添加阻碍了金线鱼肌球蛋白的交联，而8% SPI添加量时金线鱼肌球蛋白的G'与G''值再次上升的原因可能是过量的SPI加热后本身所具有的粘弹性对金线鱼肌球蛋白凝胶基质的强化作用大于SPI对金线鱼肌球蛋白的稀释作用。综上，添加4% SPI组样品的G'值与G''值最大，表明添加4% SPI时金线鱼肌球蛋白凝胶的粘弹性最好，此结果和凝胶强度、质构特性的结果一致。

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 SPI添加量对金线鱼肌球蛋白凝胶化学作用力的影响

由图7可知，疏水相互作用是维持蛋白构象稳定的主要作用力，离子键占比最小。蛋白质受热变性，离子键断裂、疏水基团暴露，相邻蛋白分子之间疏水部分的结合可以降低凝胶体系熵值，促进蛋白间相互作用，从而增强凝胶强度。氢键主要维持蛋白质的二级结构，它是转变β-折叠的主要驱动力。随着SPI添加量的增加，疏水相互作用呈现出先下降后上升再下将最后上升的趋势，氢键含量呈现出先增加后减少的趋势，离子键含量呈现出先减少后略微增大的趋势。添加SPI后离子键含量减小可能是由于SPI阻止了蛋白质之间和金线鱼肌球蛋白内部离子键的形成，使金线鱼肌球蛋白分散，当加入过多的SPI时，pH值的差异可能会改变氨基酸的电荷分布位点，导致离子键略有增加；氢键含量增加可能是由于添加的SPI与自由水结合，导致总体蛋白与水分子间的作用增强，氢键增加，而3% SPI添加量之后氢键又减少可能是由于过量的SPI与金线鱼肌球蛋白竞争水分子，使蛋白质与水分子间的作用减弱，氢键减少；添加2%和6% SPI时疏水相互作用下降可能是由于SPI吸水后粘度变大，限制了部分蛋白质分子的伸展和分子内部疏水基团的暴露以及6%时过量的SPI对暴露出来的疏水基团的再次埋藏作用，3%~4%适量的SPI的添加促进了金线鱼肌球蛋白分子内部疏水基团的暴露，和巯基变化规律相似，而8%较多过量的SPI添加由于SPI自身可形成凝胶网络，可显著增加疏水相互作用。在0%~8%的SPI添加量范围内，3% SPI添加量时氢键值最大、离子键值最小，4% SPI添加量时疏水相互作用值最大，表明3%~4%的SPI添加量范围内金线鱼肌球蛋白凝胶的化学作用力最有利于蛋白构象的稳定，从而利于金线鱼肌球蛋白凝胶特性的改善，与前面的试验结果一致。

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 SPI添加量对金线鱼肌球蛋白凝胶分子构象的影响

红外光谱图中酰胺A振动波段（3500~3250 cm−1）与O-H振动伸缩有关，其吸收峰的变化主要受氢键的影响；酰胺Ⅰ带（1600~1700 cm−1）常与酰胺Ⅲ带（1220~1330 cm−1）结合分析蛋白质的二级结构。由图8可知，在3290 cm−1附近有一个较为明显的吸收峰，这是由蛋白质羟基和 N-H 的伸缩振动引起的，添加0%、2%、3%、4%、6%、8% SPI时该峰的波数分别为3293.453、3292.488、3291.524、3291.524、3290.560和3291.524 cm−1。与对照组相比，随着SPI添加量的增加，实验组该峰值对应的波数发生不同程度的降低，表明混合凝胶中氢键增强，与图7结果一致，而增强的氢键是混合蛋白凝胶强度增加的原因之一。添加SPI前后的峰位和峰形基本相同，说明添加SPI没有改变金线鱼肌球蛋白的功能性基团，也没有新的功能性基团生成。

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SPI添加量对金线鱼肌球蛋白凝胶微观结构的影响

金线鱼肌球蛋白凝胶的微观结构与其凝胶特性密切相关。如图10所示，对照组凝胶有大而不规则的孔洞且表面粗糙。0~4%的添加量范围内，随着SPI添加量的增加，凝胶表面孔洞减少且变得光滑、结构更加致密；4%~8%的添加量范围内随着SPI添加量的增加，凝胶表面再次变得粗糙，孔洞增加但孔径较小。金线鱼肌球蛋白凝胶微观结构的改变可能与SPI对其凝胶网络的修饰有关，适量的SPI会填充在金线鱼肌球蛋白网络中，诱导蛋白质结构展开，暴露出更多的巯基和疏水性基团，并在加热后α-螺旋转化为β-折叠，最终导致凝胶网络结构更加致密均匀，而过量的SPI会黏附在金线鱼肌球蛋白凝胶网络上，形成厚的丝和孔，阻碍金线鱼肌球蛋白的交联。添加4% SPI时，金线鱼肌球蛋白凝胶网络结构最致密均匀，且表面平整，这与凝胶强度、质构特性、总巯基、化学作用力和流变特性的试验结果一致。Lin等研究发现将14%（w/w）的植物蛋白混合物加入肌原纤维蛋白中，形成的混合蛋白凝胶的微观结构更加致密均匀，与本文的结果相似。