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兰州理工大学任海伟教授等为了解高水分尾菜在不同季节气候温度下的青贮可行性，提高尾菜及时转化处理利用率，以白菜废弃物为原料，模拟兰州地区不同季节的气候温度，考察了不同温度对尾菜青贮发酵过程中感官质量、有机组分、发酵特性的影响，并结合高通量测序技术解析微生物菌群多样性，探索不同温度下微生物菌群与尾菜青贮品质之间的关系，以期为实现尾菜资源的青贮利用奠定理论基础。
由表1可知,青贮发酵 30 d 后，低温 A 组和中温 RA 组的感官质量均为优良，有明显芳香味，废弃白菜的物理结构保持良好，外观呈淡黄色: 高温 HA组的颜色变为淡褐色，且芳香味较弱，感官等级为尚好。但由于感官评价不确定因素较多,需结合组分分析和发酵特性分析对青贮品质进行综合评判。
可溶性碳水化合物( WSC) 和粗蛋白( CP) 等营养物质能给乳酸菌等菌群发酵提供能量，温度通过影响微生物对营养物质的代谢速率来调控干物质(DM)和有机组分含量的消长变化。由表 2 可知，与原料相比,青贮 30 d 后 OA 组与 RA 组的 DM 含量显著升高(P <0.05)；且 3 d 时 OA 组的 DM 含量显著高于 RA 组和 HA 组,但后两者之间差异不显著(P<0.05)。同时，DM 含量随温度升高呈下降趋势。这可能是因为青贮过程中乳酸菌、肠细菌和梭菌的最适温度为 37C 左右,这些微生物的活性在低于最适温度时会随温度升高而增强,加快了营养物质的分解。
WSC 可直接被乳酸菌利用并产生有机酸,适宜的 WSC 含量有助于获得优良青贮品质。和对照(0 d)相比,30 d 时 3 个处理组的 WSC 含量均显著下降(P <0.05);且随着温度的升高，WSC 含量呈先下降后上升趋势，OA 组中 WSC 含量显著高于 RA 和HA 组(P <0.05),HA 组显著高于 RA 组(P < 0.05)这是因为温度不同会导致微生物菌群的活性存在差异,从而产生不同的 WSC 消耗速率;低温时微生物活动微弱,使 WSC 含量保存较好。另一方面,蛋白质在植物或微生物蛋白酶的作用下会发生降解，温度会影响微生物及酶活性,进而使蛋白质分解速率产生差异。和对照(0 d)相比,青贮发 30 d 时3个处理组 CP含量均显著下降( P< 0.05),并随温度升高呈现先升高后下降趋势,RA 组中 CP 含量显著高于 OA 和 HA 组(P < 0.05)OA 组和 HA 组之间无显著性差异(P>0.05)。可见,中温(18±1)°C条件有助于乳酸菌等有益微生物利用 WSC 繁殖代谢，并能更好地保存蛋白组分。
木质纤维含量的高低是影响青贮饲料消化率的首要因素。酸性洗涤纤维( ADF)含量越低,饲用价值越高;中性洗涤纤维( NDF)含量越高，会使饲料消化率降低,从而降低青贮品质。另一方面,木质素、纤维素( CL) 和半纤维素( HC)三种组分相互包裹、缠绕构成复杂的木质纤维网络结构，也会影响动物摄入后在体内的消化降解性能。
如表 3 所示，青贮发酵 30 d 时,3 个处理组中的木质纤维组分含量发生了明显变化。与原料相比低温 OA 组中 ADF 和 NDF 含量显著增加(P <0.05),RA 组中 ADF 和 NDF 含量显著下降( P <0.05),而 HA 组中 ADF 和 NDF 含量无显著变化(P>0.05)。3 个处理组的酸性洗涤木质素( ADL)含量均显著低于原料(P <0.05),从而使 CL 和 HoC 含量显著增加( P< 0.05)。从温度影响角度来看,OA组中 ADF、CL 和 HoC 含量显著高于 RA 组和 HA 组(P<0.05),且 RA 组中这三种组分显著低于 HA 组(P<0.05)。说明低温和高温青贮发酵时的纤维含量相对较高，中温有助于减少纤维含量，提高饲用价值。
青贮过程中对 pH变化起决定作用的是乳酸菌等有益菌群，而温度会通过影响乳酸菌繁殖代谢活性来影响青贮品质，温度过低或过高都不利于乳酸菌生长。优良青贮的pH 范围一般为 3.7~4.2。如图1所示,发酵 30 d 时 3个处理组的 pH 均低于 4.2，且随温度的升高是现先上升后下降的趋势，RA 组的 pH 显著高于 OA 组和HA 组(P <0.05),达到 3.95。
氨氮/总氮(AN/TN) 也是评价青贮发酵品质优劣的重要指标。氨氮主要由植物酶和梭状芽抱杆菌等微生物分解蛋白质和氨基酸所产生AN/TN 比值越大,发酵品质就越差。优质青贮的 AN/TN 一般低于 10%。试验中,3 个处理组的 AN/TN 均低于5%，其中 RA 组和 HA 组的 AN/TN 显著高于 OA 组( P <0.05)但 RA 组与 HA 组之间差异不显著(P>0.05)。因为中高温条件有助于蛋白分解酶活性释放和梭菌等有害微生物繁殖,蛋白质分解相对活跃，进而加剧干物质损失，这与表 2 中 DM 变化趋势相吻合。
4.2 发酵中间产物的变化
有机酸和乙醇是青贮发酵过程中微生物菌群的中间代谢产物，乳酸通常是由乳酸菌利用水溶性糖代谢产生;乙酸是乙酸菌将乙醇转变为乙酸，以及异型乳酸菌分解碳水化合物所致，具有真菌抑制功效;丙酸通常由梭菌及丙酸菌生成;丁酸是由梭菌作用于乳酸和碳水化合物 而生成;乙醇是异型发酵乳酸菌和耐酸酵母菌所产生。由表 4 可知,3 个处理组的乳酸含量随温度升高而显著下降(P < 0.05),乙酸含量则均呈现先升高后下降趋势 ;RA 组的乙酸含量显著高于其他两组(P<0.05),丙酸和丁酸含量均低于 0.1%，符合优良青贮标准。乙醇含量随温度升高呈现先下降后上升的趋势，RA 组的乙醇含量显著低于 OA 组和 HA 组(P<0.05)。上述小分子有机酸和醇类物质的联动变化,使乳酸发酵强度随温度升高而下降,这一点从LA/AA 和 LA/TOA 变化趋势可得到印证。
在序列充足前提下,为提高分析结果质量，先对原始数据进行过滤处理,得到优质序列。优质序列是有效测序序列中含有特异性扩增引物、不含模糊碱基、长度大于可供分析标准的序列。图 2 结果显示,3 个处理组的优质序列均在20000 条以上;三种温度时青贮发酵后的优势序列均高于原料，其中 RA 组的优势序列最多为 36622，为数据分析提供充足的信息来源。同样，发酵后的OTUs 数量也有明显提高，但 HA 组与原料差别不大OTUs 代表了物种丰度，由于高温 HA 条件与乳酸菌等有益微生物的最适繁殖温度范围接近,故使得乳酸菌群大量繁殖并对其他有害微生物造成竞争性抑制,使物种丰富程度有所下降。
OTUs( Operational taxonomicunits)是在系统发生学或群体遗传学研究中，为分析方便,人为给某一个分类单元( 品系、属、种、分组等)设置的同一标志，OTUs 数量亦代表物种丰度。OTUs 分布的 Venn 图能统计多个样本中所共有和独有的 OTUs 数目直观表现样本 OTUS 数目组成的相似性及重叠情况。
如图2 和图 3 所示,IA、OA、RA、HA 三组 OTUS分别为 67、84_8766。OA 组与 RA 组的 OTU 数量较原料有明显增加，HA 组丰度较原料有所降低，不后样品所含 OTUs 数量依序为 RA > OA >IA >HA说明中温青贮时微生物类群最为丰富。其中，发酵后三个处理组共有的 OTUs 数量为 49 个，并且与原料相比，三个处理组都有其独有的 OTUs,特别是 OA 组中独有的 OTUs 能够占到其全部 OTUs 的 46.4%，说明不同温度下青贮样品的物种多样性存在有一样的微生物类群,但受到温度不同的影响而产生了独特的群落差异。
稀释曲线可直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样品的物种丰富度。从稀释曲线(图4)来看,样本测序数据量为 24492,随着测序数量的增加,稀释曲线斜率逐渐降低，趋向平坦但未进入平台期,但更多的数据量只会产生少量新的OTUs,因此本次测序结果较为准确合理由图4还可知，高温 HA 组的数量最低，中温 RA 组数量最高,说明中温青贮发酵时的微生物丰富度较好,这与图 2 和图 3 中结果信息相吻合。
表达Alpha 多样性的 Coverage、Chao、Ace 和 Shannon 等指数分别用于评估物种的测序深度、丰度和多样性。Coverage 指数能反映样本真实情况，数值越高,则样本中序列未被测出的概率越低;Chao 和 Ace 指数属于群落丰度指数，数值越大，表明微生物群落丰度越高;Shannon 和 Simpson 指数用来估算微生物多样性,Shannon 指数越大、Simpson指数越低，表明样品微生物多样性越高。如表 5所示，与原料相比,3 个青贮处理组的 Chao 指数和Ace 指数均有所增加，说明发酵后的微生物群落丰富度均有所升高。另一方面，OA 组的 Shannon 指数上升,Simpson 指数下降,说明 OA 组的微生物多样性处优势地位。所有样品的 Coverage 数值都较大，说明结果可以代表样本微生物群落的真实情况。
PCA 分析是种对数据进行简化分析的技术。通过分析不同样本OTU(97% 相似性)组成可以反映样本间的差异，如样本组成越相似,反映在 PCA 图中的距离越近。如图 5 所示,每个点分别代表了一个样品,主成分分析共提取了 3 个主成分，其中第一主成分 PC1 和第二主成分 PC2 贡献率分别为 48.80% 和 21.24%，累计贡献率达到了 70.04%，可以解释变量的绝大部分信息。原料 IA 组与青贮发酵后 3 个处理组样品的距离均比较远，说明发酵前后样品的微生物群落有明显变化;RA 组与 HA 组距离较近，说明二者相似性较高。
多样本相似度树状图利用树枝结构描述和比较多个样本间的相似性和差异关系。如图 6 所示,4 组数据可分为两大类，其 IA单独为一个分支，与其他样品的群落组成差异性较大;RA、OA 与 HA 均在第二分支上,说明其趋同性较高。
由图 7 可知，原料 IA 组的门水平优势菌为变形菌门（Proteobacteria ）和拟杆菌门( Bacteroidetes ),丰度分别为 80.23% 和18.57%。青贮发酵后细菌群落主要演变为变形菌门( Proteobacteria)、厚壁菌门门( Firmicutes )、拟杆菌门门( Bacteroidetes)、放线菌门门( Actinobacteria )和蓝藻( Cyanobacteria)等。其中 OA 组的门水平优势菌主要有变形菌 门 ( Proteobacteria ) 和 厚菌门( Firmicutes),丰度分别为 47.19% 和 49.01%，RA 组中的变形菌门( Proteobacteria)丰度降为 12.07%，厚壁菌门( Firmicutes)丰度增至 87.27%,HA 组的变形菌门( Proteobacteria)丰度降至 16.67%，而厚壁菌门( Firmicutes)的菌群丰度为 82.39%,说明中高温青贮时厚壁菌门( Firmicutes)门细菌占主导优势。
变形菌门( Proteobacteria)是革兰氏阴性菌，包括大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌,它们会与乳酸菌竞争性利用 WSC,并造成 CP 含量下降和氨氮含量升高。厚壁菌门(Firmicutes)是低 GC 含量的革兰氏阳性菌,主要有产芽抱、非产芽抱和支原体菌群,可 以降解很多大分子化合物，如淀粉、蛋白质和纤维素等。发酵后变形菌门( Proteobacteria)丰度的降低和厚壁菌门门( Firmicutes) 丰度的升高使青料中的CP、NDF 和 ADF 含量均有下降趋势,这与表 3 中结果一致。可见,厚壁菌门是引起粗蛋白和纤维素等有机组分变化的主要因素。
属水平细菌群落组成如图8 所示。原料 IA 附着的细菌主要包括假单胞菌属( Pseudomonas)、泛菌属( Pantoea)、黄杆菌属( Flavobacterium)和肠杆菌属( Enterobacter) 等，其中优势菌假单胞菌属( Pseudomonas)丰度最高为48.40%。低温发后 OA 组中的乳酸杆菌属( Lactobacillus)丰度为 28.43%，耶尔森氏鼠疫杆菌( Yersnia)和肠杆菌属( Enterobacter)丰度次之,分别为 19.50% 和 17.13%，此外还有少量明串珠菌属( Leuconostoc,11.02% )、泛菌属( Pantoea ,8.62% )和乳球菌属( Lactococcus,5.73%)等。中温 RA 组和高温 HA 组的细菌群落构成类似优势菌都演变为乳酸杆菌属( Lactobacillus )，丰度分别高达 80.07% 和74.63%。另外,RA 组中的肠杆菌属(Enterobacter) 丰度为 8.62%，明串珠菌属( Leucono.stoc)丰度为 6.19%泛菌属( Pantoea)假单胞菌属( Pseudomonas)和黄杆菌属( Flavobacterium) 等细菌丰度均低于 1% ;HA 组中肠杆菌属( Enterobacter)、明串珠菌属( Leuconostoc和耶尔森氏鼠疫杆菌( Yersnia)丰度分别为 11.24%5.98%和 4.37%。另一方面，OA 组中演绎生成乳酸杆菌属( Lactobacillus)、明串珠菌属( Leuconostoc)、乳球菌属( Lactococcus)、魏斯式菌属( weissella)肠球菌禹(Enterococcus)、肉菌属( Carnobacterium)等酸细菌的总丰度之和仅 为 48.92%，肠杆菌 属( Enterobacter)和耶尔森氏鼠疫杆菌( Yersnia)等腐败菌丰度较高达到 36.63%，而 RA 组和 HA 组的乳酸菌属丰度之和分别高达 87.14% 和82.29%,使肠杆菌属( Enterobacter)等有害微生物被有效抑制。从乳酸细菌多样性来看，废弃白菜青贮发酵后的乳酸杆菌属( Lactobacillus) 比重均有明显增加，并占据主导地位。这与 Yan 和刘晶晶等报道的柳枝稷、黑麦草青贮发酵时乳酸杆菌属( Lactobacillus)为优势菌群结果一致。
总体来看，原料青贮前自身表面附着的乳酸菌群较少,生长繁殖缓慢,并与其他微生物存在竞争性抑制。一旦进入青贮发酵,乳酸菌等有益菌不断繁殖进而产生乳酸等有机酸从而降低 pH,抑制其他腐败微生物生长，并且随着温度升高,有利于提升青贮品质的乳酸杆菌属( Lactobacillus)逐渐演变为优势菌群。结合图 5 和图6 结果综合判断,青贮发酵温度的不同导致了微生物菌群种类及其丰度不断发生变化。
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