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摘要
本研究通过对黍稷麸皮多糖进行分离纯化、结构表征，并研究其抑菌活性，旨在为黍稷加工副产物中营养物质的开发利用提供参考。采用碱提醇沉法提取黍稷麸皮多糖（millet bran polysaccharides，MBP），DEAE-50、Sephadex G-100柱层析分离纯化，利用HPLC色谱、红外光谱、原子力显微镜、扫描电镜、X-射线衍射等方法对黍稷麸皮多糖结构进行分析。结果表明，MBP分子量为3.479×104 Da，单糖组成的摩尔比为甘露糖:鼠李糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖:木糖=0.11:0.13:5.86:0.62:1.00:0.52，是β型吡喃多糖。MBP具有良好的热稳定性，在形态结构方面呈片层状，连接紧密，不具备晶体结构。抑菌实验得出，MBP对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2 mg/mL。综上，从黍稷麸皮中提取得到的多糖MBP具有良好的抑菌能力。
黍稷（Panicum miliaceum L.）又称糜子、黍子，禾本科黍属一年生草本植物，广泛种植于山西、陕西等中国北方地区，含有丰富的淀粉、蛋白质、脂肪及钾、镁、钙、磷等大量元素和铁、铜、锌、硒等微量元素，具有消炎、抗氧化和预防心脑血管疾病等功效。黍稷磨米去除皮壳后称黄米，麸皮作为加工副产物，除用作动物饲料外，大部分被丢弃，开发利用程度低。所以黍稷麸皮中活性物质的提取与生物活性研究极其重要。
多糖是由十个以上的单糖聚合在一起形成的碳水化合物。现已从小麦、藜麦等禾本科植物中提取纯化出多糖，并对其进行结构表征，发现每种植物多糖具有不同的分子量与单糖组成。研究表明多糖具有多种生物活性，如抗氧化、降血糖、降血脂、免疫调节等作用，广泛应用于食品、医药等领域。如今具有抑菌活性的天然多糖也被发现，研究表明多糖类物质对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均具有不同程度的抑制效果，其对革兰氏阳性菌的抑制能力高于革兰氏阴性菌。多糖生物活性高、安全性高、毒副作用小，且从麸皮中提取多糖价格低廉，具有极高的应用价值。
目前关于黍稷麸皮多糖的抑菌活性研究未见报道，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大肠杆菌Escherichia coli作为常见食源性致病菌对人类生活产生影响，而枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis在植物生长等方面发挥作用，本研究选择这三种菌具有对比参考价值。多糖生物活性与其结构紧密相关，包括单糖组成比例、官能团类型和糖苷键连接方式等。因此，对黍稷麸皮多糖进行分离，并研究其抑菌活性与结构间的构效关系具有重要意义。本实验旨在通过采用碱提法提取黍稷麸皮多糖，并对其分离纯化，分析多糖分子量、单糖组成及结构特征，进而研究其体外抗菌活性，为黍稷加工副产物中营养物质进一步利用提供参考。
结果与分析
2.1 黍稷麸皮多糖的提取、分离和纯化
以葡萄糖质量浓度和其吸光度值绘制葡萄糖标准曲线，回归方程为y=7.314x+0.0012，R2=0.999。根据标准曲线，采用苯酚硫酸法测得黍稷麸皮多糖含量为45.7%±0.32%，如图1所示，经DEAE-50纤维素柱分级得到MBP-A（后续称MBP），由于MBP-B和MBP-C峰较小即含量较少，则不做后续研究。由图2可知，经Sephadex G-100洗脱后呈现单一对称峰，经测定纯度达到98.40%±0.09%。从图3可知，在260和280 nm处没有出现核酸和蛋白质的特征吸收峰，说明MBP不含核酸和蛋白质，纯度较高。
图 1 黍稷麸皮多糖的DEAE-50洗脱曲线
Figure 1. DEAE-50 elution curves of proso millet bran polysaccharide
图 2 黍稷麸皮多糖的Sephadex G-100洗脱曲线
Figure 2. Sephadex G-100 elution curve of proso millet bran polysaccharide
图 3 黍稷麸皮多糖的紫外光谱图
Figure 3. UV–VIS spectroscopy of proso millet bran polysaccharide
采用高效凝胶渗透色谱测定多糖分子量，图4可以看出，MBP在色谱图中呈现单一峰，保留时间8.76 min，根据标准曲线y=−1.1004x+14.181（R2=0.9984）计算，黍稷麸皮多糖MBP分子量为3.479×104 Da。
图 4 黍稷麸皮多糖凝胶渗透色谱图
Figure 4. Gel permeation chromatogram of proso millet bran polysaccharide
混合的单糖标准品色谱图见图5。采用PMP衍生化HPLC法检测黍稷麸皮多糖的单糖组成，通过与图5对比，得出黍稷麸皮多糖由6种多糖组成（见图6），摩尔比为甘露糖:鼠李糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖:木糖=0.11:0.13:5.86:0.62:1.00:0.52。MBP是一种中性杂多糖，主要单糖为葡萄糖和阿拉伯糖。与其他一些麦麸等多糖相比，虽然大多数单糖组成相似，但含量最高的单糖却有所不同，如在Shang等的研究中麦麸多糖主要由木糖与阿拉伯糖组成。
图 5 混合单糖标准品高效液相图谱
Figure 5. HPLC chromatograms of mixed monosaccharide standard
图 6 黍稷麸皮多糖的单糖色谱图
Figure 6. Composition of proso millet bran polysaccharide
采取傅里叶红外光谱对黍稷麸皮多糖官能团进行分析，由图7可知，黍稷麸皮多糖红外光谱中分子内或分子间氢键的OH伸缩振动在3336.3 cm−1处有一个强吸收峰，在2927.2 cm−1左右的弱吸收带归因于不对称的C-H伸缩振动，在1622.7 cm−1左右的吸收峰是糖环上的C-O不对称拉伸峰，这可以说明样品在4000~650 cm−1波长区域范围内是具有多糖类物质的一般性共性特征。1022.7 cm−1是吡喃环的特征吸收峰；854.5 cm−1是β型糖苷键吸收峰；在1741.18 cm−1处未观察到吸收峰，表明没有大量糖醛酸。由上可知，此多糖是一种含β型糖苷键结构的吡喃糖。
图 7 黍稷麸皮多糖傅里叶红外光谱图
Figure 7. FT-IR spectroscopy of proso millet bran polysaccharide
采用X-射线衍射法分析黍稷麸皮多糖MBP的晶体结构，一般来说，晶体材料呈尖锐的窄衍射峰，而非晶组分呈宽峰。如图8所示，MBP在20°处有一个宽的衍射峰，在32°有少量峰值较小的峰出现，并无较明显性吸收峰产生，呈现出一种无定形状态。Ren等采用XRD分析藜麦多糖（QP）及其分离纯化得到的多糖组分的构象，发现QP未经进一步分离纯化不能形成单晶，以无定形形式存在，而MBP经分离纯化后仍呈现无定形状态，这可能与提取方式以及分子量大小单糖组成等不同有关，水解程度增加、分子量和聚合度的降低等均会破坏多糖的内部晶体结构。
图 8 黍稷麸皮多糖X射线衍射结果
Figure 8. X-ray diffraction (XRD) patterns of proso millet bran polysaccharide
采用扫描电镜观察黍稷麸皮多糖MBP的表观形貌，如图9所示，SEM图中多糖呈现不规则片状，结构疏松，分子间存在空隙，图中观察到一些光滑的球形颗粒和棒状结构，为多糖聚合物之间的相互连接提供机会。Shang等从小麦麸皮中提取的多糖呈光滑片状形态，表面边缘有褶皱。多糖的形态结构受到原料来源或提取工艺的影响，如超声波产生的强剪切力会使多糖形态粗糙多孔。
图 9 黍稷麸皮多糖SEM图
Figure 9. SEM images of proso millet bran polysaccharide
采用原子力显微镜观察黍稷麸皮多糖MBP的分子形貌，如图10所示，AFM图上出现了相对均匀的颗粒状结构，多糖分子高度最高为12.46 nm。有研究表明，多糖中的单链高度一般在0.1~1.0 nm范围内，所以推断图中的线性链结构是由多条链通过范德华力或氢键连接缔合形成的凝聚结构。
图 10 黍稷麸皮多糖AFM图
Figure 10. AFM images of proso millet bran polysaccharide
采用TG-DSC分析黍稷麸皮多糖MBP的热力学性质，如图11所示，黍稷麸皮多糖热重变化主要分为3个阶段：第1阶段，室温至193.94 ℃，质量损失率为9.17%，质量损失主要是失去了多糖分子中的自由水和结合水；第2阶段，193.94 ℃至389.47 ℃，质量损失率为62.89%，此阶段多糖质量损失率加快，热降解速率和重量损失达到最大值，主要可能是高温使多糖分子碳链和氢键被破坏，多糖分子被分解；第3阶段，389.47 ℃至800 ℃，样品损失率较慢，质量损失率为7.38%。这可能是由炭的热分解引起的。王鑫等的研究表明小麦麸皮多糖在30～132 ℃温度范围内具有较好的稳定性，与之相比，黍稷麸皮多糖在室温至193.94 ℃范围内保持稳定，说明黍稷麸皮多糖的热稳定性更好。差示扫描量热分析（图12）显示黍稷麸皮多糖分别在63.25、257.66、291.29、354.17 ℃有吸热反应。这可能是由于脱水或外围多糖链和脱羟基化反应，在保护性气体（氮气）的保护下并无放热峰的产生，说明黍稷麸皮多糖MBP是一种无定形性多糖，这与X射线条件下的试验结果一致。结果表明，多糖MBP的热稳定性良好，可作为添加物用于需高温处理食品中。
图 11 黍稷麸皮多糖的热重分析结果
Figure 11. Rmogravimetry analysis curves of proso millet bran polysaccharide
图 12 黍稷麸皮多糖的差示扫描量热分析
Figure 12. Scanning calorimetry curve of proso millet bran polysaccharide
由表1可知，黍稷麸皮多糖提取物对3种指示菌中的金黄色葡萄球菌表现出较强的抑制作用，MIC值为2 mg/mL，对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌抑制作用不明显。黍稷麸皮多糖提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌抑菌圈直径分别为16.10±0.32，9.30±0.00，10.70±0.32 mm，其中大肠杆菌抑菌圈直径高于对照青霉素组。多糖对革兰氏阳性菌的抑菌能力高于革兰氏阴性菌，可能是因为阳性菌的细胞膜比阴性菌敏感，这与前人关于茯苓多糖抑菌实验结果一致。周欣研究结果表明香菇多糖对大肠杆菌抑菌作用最强，MIC为1.25 mg/mL，这可能是由于香菇多糖和黍稷麸皮多糖在结构方面存在差异；香菇多糖对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌MIC均为2.5 mg/mL，黍稷麸皮多糖对金黄色葡萄球菌的抑制作用略高于香菇多糖。魏磊等研究得出赤松茸多糖对金黄色葡萄球菌的MIC为25 mg/mL。与之相比，本研究的黍稷麸皮多糖抑菌活性明显高于赤松茸多糖，且成本更低。因此，利用黍稷麸皮生产饲用多糖作为一种新型、天然的抑菌剂具有良好的开发前景。
表 1 黍稷麸皮多糖抑菌活性
Table 1. Bacteriostatic activity of proso millet bran polysaccharide
结论
引用本文：陈燕云，平华，高媛，等. 黍稷麸皮多糖分离纯化、结构表征及抑菌活性分析[J]. 食品工业科技，2024，45（10）：1−7. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2023090118.
Citation: CHEN Yanyun, PING Hua, GAO Yuan, et al. Isolation, Purification, Structure Characterization and Antibacterial Activity of Polysaccharides from Proso Millet Bran[J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(10): 1−7. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2023090118.
基金项目： 山西省现代农业产业技术体系建设专项资金资助（2023CYJSTX03-33）；山西省重点研发计划（202102140601014）；北京市农林科学院科技创新能力建设专项（KJCX20230817）；科技部重点研发计划（2020YFD1001405）。
通信作者简介
（以上信息来自山西大学生命科学学院官网）
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