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入选中国科技期刊卓越行动计划
本文获国家重点研发计划项目“杂粮产业链一体化示范”(2020YFD1001400);江淮杂粮产业工程技术研发创新基地项目。
摘要
为探究酶解法提取白芸豆多肽(White kidney bean polypeptides,WKBPs)的最佳工艺条件及体外降血脂活性片段,本研究以白芸豆蛋白为原料,通过单因素结合响应面试验优化提取WKBPs的最佳工艺条件,分析白芸豆蛋白酶解前后氨基酸组成变化,采用超滤管对提取的白芸豆粗肽进行分级分离,测定不同组分WKBPs体外降脂活性,并利用分子对接探究肽段与胰脂肪酶之间的结合能力与作用靶点。结果表明:在酶解温度51 ℃、酶解时间3 h、酶添加量3000 U/g、酶解pH10.0条件下WKBPs胰脂肪酶抑制率为83.58%±0.65%;与未水解的白芸豆蛋白相比,水解之后的WKBPs必需氨基酸从31.51±0.22 g/100 g极显著增加到35.97±0.06 g/100 g,疏水性氨基酸从29.47±0.25 g/100 g极显著增加到34.15±0.11 g/100 g,总氨基酸含量从83.21±0.11 g/100 g极显著增加到94.08±0.12 g/100 g(P<0.01);超滤结果显示Mw<3000 Da的WKBPs体外降血脂活性(胆固醇酯酶、胰脂肪酶、牛磺胆酸钠抑制率)最佳,其半抑制浓度(IC50)分别为1.43、0.28和0.90 mg/mL;通过虚拟筛选评估质谱检测出的2997条肽段,得到肽RPPFDPY与胰脂肪酶结合能最低,亲和力最好,分子对接结果显示,肽RPPFDPY能够通过氢键、疏水相互作用等作用力与胰脂肪酶之间形成稳定的构象。本研究为开发降血脂新型白芸豆功能食品提供了充分的理论依据及数据支撑。
高脂血症,是由于体内脂肪堆积导致的血脂水平异常的代谢性疾病,是导致高血压、糖尿病、冠心病发病的主要因素之一,高血脂可诱发动脉粥样硬化,使心血管疾病的发病率及死亡率升高。根据《中国居民营养与慢性病状况报告(2020年)》显示,我国居民高血脂总体患病率高达35.6%。目前,他汀类药物、甜菜碱等降脂药已广泛用于治疗高脂血症,但大量的使用这类药物会产生一定的副作用,如胃肠道功能紊乱、肝衰竭等。因此,开发能够修复人体氧化损伤、改善血脂水平的功能性食品显得尤为重要。
芸豆学名菜豆,豆科菜豆属(Phaseolus vulgaris L.),起源于中南美洲和安第斯山脉一带,是我国食用豆类中出口量最大的特色杂豆作物。芸豆营养均衡,富含人体必需的氨基酸、蛋白质、维生素等营养成分,还含有多糖、多肽等活性物质,是一种极具药用价值的食品,也是心脏病和高脂血症患者的食用优选。研究表明,芸豆提取物具有良好的抗氧化活性和增强免疫力的作用,改善氧化应激水平。白芸豆中α-淀粉酶抑制剂糖蛋白具有调节高血脂模型大鼠血脂的功效。Jawad通过湿热-超声处理绿豆蛋白制备多肽呈现出更高的胆固醇抑制作用。姚余祥等通过碱性蛋白酶酶解鹰嘴豆制备多肽,动物试验显示鹰嘴豆肽可使大鼠体内胆固醇含量降低22.39%。白芸豆提取物能减轻肥胖大鼠体重,减少体内脂肪堆积,调节脂质代谢,能起到良好的减肥作用。综上所述,芸豆提取物能够调节血脂代谢异常的情况,但是对于芸豆多肽降血脂方面的研究较少,具体作用机制尚未完全明确,还有待进一步研究。
酶解法是通过不同来源(微生物、植物、动物等)的蛋白酶对蛋白质进行水解,促使蛋白质内部释放出不同活性的肽段,酶解法制备多肽能够形成特定的肽链,使其有不同的功能活性。分子对接是一种利用受体与配体间的相互作用来预测蛋白质与蛋白质的结合方式及亲和度的理论模拟方法。在分子对接技术研究降血脂肽的作用机制中,常见的降血脂的靶点有胰脂肪酶、胆固醇酯酶、脂蛋白酯酶等,侯一峰研究显示生物活性肽与胆固醇分子之间通过氢键和疏水相互作用形成稳定的结合,表明生物活性肽能够起到胆固醇外排的作用。目前,虽有大量研究报道了芸豆多肽在抗氧化、降血压等方面的生物活性,但有关酶解法制备高活性的白芸豆降脂肽,再利用虚拟筛选和分子对接技术探究白芸豆降脂肽与抑制酶之间的结合方式的研究还甚少。
因此,本文以白芸豆蛋白为原料,采用酶解法制备具有较高活性的降血脂肽,通过超滤技术筛选降血脂活性最好的组分,并利用分子对接探究肽段与抑制酶之间的结合能力。本实验为高脂血症患者提供食用选择,为白芸豆的开发利用拓宽新的途径。
结果与分析
图 1 不同蛋白酶对WKBPs胰脂肪酶抑制率的影响
Figure 1. Effect of different proteases on the rate of pancreatic lipase inhibition in WKBPs
注:图中不同字母表示差异显著,P<0.05;图2、图5~图8同。
2.2 单因素实验结果
由图2(B)可知,胰脂肪酶抑制率随酶解温度升高呈先增加后降低的趋势,在酶解温度为50 ℃时达到最高为83.02%±0.88%。推测与酶的最适温度有关,温度过高会使蛋白酶失活,导致酶解速率下降。因此,选择酶解温度为50 ℃进行下一步实验。
由图2(C)可知,胰脂肪酶抑制率呈先增大后减小的趋势,当料液比达到1:15时,胰脂肪酶抑制率最高为82.89%±0.69%。当底物浓度过高时,蛋白质不能与碱性蛋白酶充分接触,过低时可能会导致分子扩散受阻,酶解速率降低,所得多肽浓度较低。因此,选择料液比为1:15进行下一步实验。
由图2(D)可知,随pH的增加胰脂肪酶抑制率呈先升高后下降的趋势,在pH为10.0时达到最大值为83.25%±0.75%。这是由于随着pH的升高,酶解体系的碱性环境更适合蛋白质水解,使多肽含量增加,在pH为10~11范围内抑制率下降可能是由于pH过高会破坏蛋白质和酶的空间结构,导致多肽含量降低,使抑制率下降,因此,选择酶解pH为10.0进行下一步实验。
如图2(E)所示,胰脂肪酶抑制率呈先增加后减小的趋势,在3000 U/g时达到最高,为83.47%±0.81%。这是由于酶与底物完全接触,蛋白质水解成小分子多肽的含量增加,使得抑制率升高,而当酶添加量过高时,会使水解产生的多肽继续水解,将已经具有抑制胰脂肪酶活性的多肽继续水解为没有活性的多肽片段,导致降血脂活性降低。因此,选择酶添加量为3000 U/g进行下一步实验。
图 2 单因素实验结果
Figure 2. Results of the one-factor test
2.3 响应面优化试验结果分析
2.3.1 响应面结果分析
本实验以酶解温度(A)、酶解时间(B)、酶添加量(C)、酶解pH(D)4个因素作为自变量,以胰脂肪酶抑制率为响应值,设计4因素3水平试验。设计方案及试验结果见表3。
表 3 Box-Behnken 试验设计及结果
Table 3. Box-Behnken test design and results
对表3中的试验数据进行多元二次多项式回归拟合,得到二次多项回归方程:
Y=84.29+0.61A−0.18B+0.30C−0.54D+2.34AB−0.015AC−1.83AD−0.037BC−0.76BD−0.16CD−5.20A2−4.91B2−5.27C2−5.24D2
回归模型方差分析表4中的P值可以反映各因素的显著性,F值可以反映各因素对实验模型的影响。回归模型的显著性为P<0.0001,表明设计模型具有极显著差异,说明实验方法具有可信度。在回归方程中,二次项A2、B2、C2、D2差异极显著(P<0.01),说明各因素对实验具有显著影响。模型中失拟项F值为2.25,P值为0.2263(P>0.05),差异不显著,表明所建立的回归模型受到实验操作等意外因素的影响较小,胰脂肪酶抑制率的影响因素分别为酶解温度>酶解pH>酶添加量>酶解时间。以上结果表明,所建立的响应面试验具有可靠性,模型的拟合度高,符合WKBPs在不同实验条件下的变化规律,可用该模型确定WKBPs的最佳酶水解条件。
表 4 回归模型方差分析
Table 4. ANOVA of regression models
注:P<0.01为极显著,用**表示,P<0.05为显著,用*表示,P>0.05为不显著。
2.3.2 交互作用分析
响应面结果如图3所示。各因素交互对胰脂肪酶抑制率的影响均呈现先升高后降低的趋势,在响应面图中出现最大值,AB、AD、BD两因素交互等高线图呈现椭圆形,说明两因素交互作用显著,这与方差分析表中结果一致,在一定的酶解时间下,随酶解pH和酶解温度的增加,响应曲面迅速变化,说明WKBPs抑制胰脂肪酶主要受酶解pH和酶解温度的影响。
图 3 各因素交互对胰脂肪酶抑制率的影响
Figure 3. Effect of each factor interaction on the rate of pancreatic lipase inhibition
2.3.3 最佳实验条件及验证
通过软件分析获得白芸豆降脂肽的最佳提取条件为酶解时间3 h、酶解温度50.69 ℃、酶添加量3028 U/g、酶解pH9.96,此时的胰脂肪酶抑制率为84.33%,结合实际应用,调整条件为酶解时间3 h、酶解温度51 ℃、酶解pH10.0、酶添加量3000 U/g,得到胰脂肪酶抑制率为83.58%±0.65%,与预测值相近,故得知此模型有较高的可行性。
2.4 氨基酸组成分析
氨基酸的组成以及在肽链上的排列顺序与活性肽的功能作用密切相关,据报道,疏水性氨基酸(缬氨酸、亮氨酸等)可调节脂蛋白代谢,与脂肪酶的活性位点结合,改变其空间构象,从而抑制脂肪酶的活性,减少脂肪的水解和吸收,本实验对白芸豆蛋白水解前后氨基酸组成成分变化进行分析,结果如表5所示,在WKBPs中检测出17种氨基酸,其中疏水性氨基酸有7种,与未水解的白芸豆蛋白相比,水解之后的白芸豆必需氨基酸从31.51±0.22 g/100 g极显著增加到35.97±0.06 g/100 g(P<0.01),必需氨基酸占比从37.88%增加到38.24%;疏水性氨基酸从29.47±0.25 g/100 g极显著增加到34.15±0.11 g/100 g(P<0.01),氨基酸占比从35.41%增加到36.30%;总氨基酸含量从83.21±0.11 g/100 g极显著增加到94.08±0.12 g/100 g(P<0.01)。有研究表明疏水性氨基酸能与胆汁酸形成不溶性混合物通过肠道排出体外,疏水性氨基酸含量越高,对人体内胆固醇调节作用越显著。因此可推测WKBPs具有一定的调节血脂异常的能力。
表 5 氨基酸组成成分分析
Table 5. Analysis of the amino acid composition
2.5 分子量分布
WKBPs分子量分布结果如表6和图4所示,Mw<3000 Da的肽段含量为90.57%,Mw<1000 Da的肽段含量为72.48%,1000~3000 Da的肽段含量为18.09%,Mw>3000 Da的肽段含量为9.44%,说明WKBPs分子量主要集中在3000 Da以下,研究表明,多肽分子质量越小越容易穿过屏障,发挥其降血脂活性,这一结果与杨晓月的研究一致,推测这部分肽段是降血脂的主要片段。
表 6 多肽相对分子质量分布结果
Table 6. Results of the relative molecular mass distribution of polypeptides
图 4 多肽相对分子质量分布
Figure 4. Relative molecular mass distribution of peptides
2.6 超滤组分体外降血脂活性
经超滤后将WKBPs按照分子量大小进行分离,将其分成WKBPs-1(Mw>5 kDa)、WKBPs-2(3 kDa<Mw<5 kDa)、WKBPs-3(Mw<3 kDa)3个组分,结果如图5所示,各组间存在显著差异(P<0.05),当浓度为1 mg/mL时,Mw<3 kDa的WKBPs对胆固醇酯酶、牛磺胆酸钠、胰脂肪酶的抑制作用最好,分别为45.85%±0.89%、67.56%±0.86%、67.35%±0.79%,可推测出低分子量的多肽组分可能暴露出更多的活性位点而表现出更好的酶活性抑制作用,因此,选择Mw<3000 Da组分进行后续实验。
图 5 不同组分多肽的体外降脂活性
Figure 5. In vitro lipid-lowering activity of peptides of different components
2.7 体外降血脂活性
2.7.1 胆固醇酯酶抑制率
胆固醇酯酶将食物水解转化为胆固醇,胆固醇溶解在胶束中被人体吸收,所以对胆固醇酯酶的抑制可以降低对胆固醇的吸收。如图6所示,随着WKBPs-3浓度的增加,对胆固醇酯酶的抑制作用显著增加(P<0.05),在5 mg/mL时对胆固醇酯酶的抑制率达到最高为63.52%,低于阳性对照辛伐他汀,其IC50值为1.43 mg/mL,随着浓度的增加抑制作用越明显,这是由于在一定的质量浓度范围内,多肽分子越多,与胆固醇酯酶接触面积越大,能够使更多的胆固醇酯酶被破坏,从而达到抑制血脂的作用,WKBPs-3的胆固醇酯酶的抑制率更强,表明WKBPs-3具有较好的胆固醇酯酶抑制能力。
图 6 不同WKBPs-3浓度对胆固醇酯酶的抑制作用
Figure 6. Inhibition of cholesteryl esterase by different WKBPs-3 concentrations
2.7.2 胰脂肪酶抑制率
胰脂肪酶将甘油三酯水解成甘油单酯和脂肪酸,被肠道吸收导致肥胖,所以可以通过抑制脂肪酶的活性,减少脂肪吸收达到降血脂的效果。如图7所示,在一定浓度范围内,WKBPs-3对胰脂肪酶抑制率呈剂量依赖关系,随着WKBPs-3浓度的增加而增加,在WKBPs-3为4 mg/mL时,胰脂肪酶抑制率最高,为70.15%,IC50为0.28 mg/mL,略低于阳性对照辛伐他汀,随浓度的增加,对胰脂肪酶的抑制作用越明显,这可能是由于多肽含量的增加,增大了多肽与胰脂肪酶的接触面积,抑制了胰脂肪酶的活性,从而抑制胆固醇的消化吸收,降低了胆固醇水平,表明WKBPs具有较强的体外降血脂活性。
图 7 不同WKBPs-3浓度对胰脂肪酶的抑制作用
Figure 7. Inhibition of pancreatic lipase by different concentrations of WKBPs-3
2.7.3 牛磺胆酸钠抑制率
牛磺胆酸钠是肝脏中胆汁酸的主要成分,肝脏中胆酸盐含量的降低可促进胆固醇的分解代谢,从而达到降血脂的效果。如图8所示,牛磺胆酸钠抑制率随浓度的增加而增加。在WKBPs-3浓度为1 mg/mL时,牛磺胆酸钠抑制率达到最大值,为62.66%,略低于阳性对照辛伐他汀,其IC50为0.90 mg/mL,随浓度增加胆酸盐结合能力更强,这可能是因为多肽含量越多,对牛磺胆酸钠的吸附作用越强,胆酸盐的含量降低促使胆固醇代谢分解,表明WKBPs-3具有更好的调节血脂的效果。
图 8 不同WKBPs-3浓度对牛磺胆酸钠的抑制作用
Figure 8. Inhibition of taurocholate sodium by different WKBPs-3 concentrations
2.8 白芸豆降脂肽的虚拟筛选及分子对接
2.8.1 LC-MS/MS质谱检测
为探究白芸豆降血脂肽具体的氨基酸序列,对MW<3000 Da的WKBPs用LC-MS/MS进行序列鉴定。WKBPs一级质谱图和肽段比例分布图如图9和图10所示,在WKBPs-3中共检测出2997条肽段,其中4肽、5肽、6肽、7肽占比约75%。
图 9 WKBPs一级质谱图
Figure 9. First-order mass spectrum of WKBPs
图 10 WKBPS-3肽段比例分布图
Figure 10. Distribution map of WKBPS-3 peptide ratios
2.8.2 虚拟筛选
由于前期体外降脂实验验证WKBPs-3对胰脂肪酶抑制效果最佳,分子对接选择胰脂肪酶为受体进一步验证WKBPs-3的降血脂效果。配体分子与受体蛋白的结合能小于−7.0 kcal/mol,证明它们亲和效果越好,组成的构象更稳定,采用PyRx软件筛选质谱鉴定出的2997条肽段,筛选出WKBPs-3与胰脂肪酶结合能最高的十个肽段,如表7所示,肽RPPFDPY与胰脂肪酶的结合能最低,为−10.4 kcal/mol,表明肽RPPFDPY与胰脂肪酶有强烈的结合能力。肽RPPFDPY的二级质谱图及化学结构如图11所示,图中蓝点表示b离子碎片的质量差,红点表示y离子碎片的质量差,b1和b5之间的差值接近苯丙氨酸的分子质量,这说明b1和b5之间可能发生了苯丙氨酸残基的化学键断裂,b1和b2之间可能发生了天冬氨酸的结构变化,以上结果可推测出肽RPPFDPY发挥功能活性的氨基酸主要为苯丙氨酸和天冬氨酸。
表 7 WKBPs与胰脂肪酶结合能最高的十个肽段
Table 7. Ten peptides with the highest binding energy of WKBPs with pancreatic lipase
图 11 肽RPPFDPY的二级质谱图及化学结构
Figure 11. Secondary mass spectrometry and chemical structure of peptide RPPFDPY
注:二级质谱图中的横坐标代表碎片离子质荷比,纵坐标表示碎片离子相对丰度值。
2.8.3 分子对接
为了进一步从分子水平上探究肽RPPFDPY的降血脂能力,通过受体-配体相互作用分析,肽RPPFDPY与胰脂肪酶分子对接模拟结果如图12所示,胰脂肪酶的氨基酸残基组成的空腔紧密包裹肽RPPFDPY,使肽RPPFDPY处于胰脂肪酶的活性中心,与胰脂肪酶的氨基酸残基Cys26、Gly25、Leu24、Arg180、Leu205、Ser211、Glu177、Gly176、Leu208存在疏水相互作用,减少了水的介入,有利于形成稳定的复合物,限制胰脂肪酶发挥活性。此外,肽RPPFDPY与Glu204、Asn183、Arg207形成氢键,与Ser211形成碳氢键,氢键的形成极大地促进RPPFDPY与胰脂肪酶紧密结合形成复合物,阻碍了胰脂肪酶和底物的结合。从活性位点来看,肽RPPFDPY与胰脂肪酶又形成了3个活性位点(Arg181、Asp212、Asp209),说明肽RPPFDPY可以与胰脂肪酶的活性位点的氨基酸残基结合抑制其催化活性,从而对胰脂肪酶产生更强的抑制作用。对接结果表明肽RPPFDPY与靠近活性位点的氨基酸残基结合,通过氢键、疏水作用占据了胰脂肪酶的活性位点,这些相互作用使多肽与胰脂肪酶之间形成复合物或影响酶的构象,从而影响胰脂肪酶的正常生理功能,这可能使得肽RPPFDPY具有更好的抑制脂肪酶活性的作用。
图 12 肽RPPFDPY与胰脂肪酶分子对接结果
Figure 12. Results of the docking of the peptide RPPFDPY with the pancreatic lipase molecule
注:A为肽RPPFDPY与胰脂肪酶对接整体图;B为肽RPPFDPY与胰脂肪酶对接细节图;C为肽RPPFDPY与胰脂肪酶氨基酸相互作用细节图。
Citation:ZHANG Yunxi, LIU Tong, WANG Ying, et al. Optimization of Extraction Process and in Vitro Hypolipidemic Activity of White Kidney Bean Protein Source Lipid-lowering Peptide[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(23): 271−282. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024120043.
通讯作者简介
张璐,女,中国食品发酵工业研究院食品工程研究发展部GI国际合作与科普食育中心中心主任,农学博士,美国康奈尔大学访问学者,高级工程师。主要从事食物血糖生成指数(GI)研究与科普推广、功能性食品开发与精准营养及功效评价等相关工作,先后搭建体外模拟消化、体外模拟结肠发酵以及生物分子互作等研究体系。截至目前,作为科研骨干参与“十四五国家重点研发计划”、“十三五国家重点研发计划”、“北京市科技计划”、“公益性行业(农业)科研专项”以及“河北省重大科技专项”等国家重点研发、省部级及地方科研项目10余项,目前累计发表学术论文30余篇,授权国内外发明专利3项,荣获中国商业联合会、中国食品工业协会等科技奖4项,参与地方食品产业发展规划2部。
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