中央引导地方项目|黑龙江八一农垦大学王长远教授、曹荣安教授：黑豆蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备及功能特性分析

摘要：为了筛选黑豆蛋白中具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的肽段，采用双酶复合水解法酶解黑豆蛋白制备α-葡萄糖苷酶抑制肽，并通过超滤、液相色谱-串联质谱和分子对接技术对黑豆蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽进行分离、鉴定和筛选，最后验证其体外活性。结果表明，利用中性蛋白酶酶解180 min后再用碱性蛋白酶酶解180 min，制得的黑豆蛋白酶解物，在浓度为2 mg/mL时对α-葡萄糖苷酶抑制率为45.81%±0.51%。酶解物经超滤后，其中Ⅰ组（<1 kDa）浓度为2 mg/mL时，α-葡萄糖苷酶抑制率高达81.29%±1.11%。在Ⅰ组分中鉴定并筛选出了1条溶解性好、无毒、无致敏性且未曾被报道过的α-葡萄糖苷酶抑制肽KGLF（Lys-Gly-Leu-Phe），该肽与α-葡萄糖苷酶的对接结合能为−3.69 kcal/mol，经体外验证其IC₅₀值为5.26×10⁻³ mg/mL，显著低于黑豆蛋白酶解液Ⅰ组（P<0.05）。综上，本研究通过双酶复合水解黑豆蛋白成功制备并筛选高活性降糖肽，可以为黑豆深加工和制备高附加值的功能性产品提供理论依据。

PART.01

结果

图  1   五种蛋白酶对黑豆蛋白的水解度以及酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率

Figure  1.   Degree of hydrolysis of five proteases on black bean protein and the α-glucosidase inhibition rate of enzymatic hydrolysis products

注：不同字母表示同一指标差异显著（P<0.05）。

图  2   黑豆蛋白酶解物的分子量分布

Figure  2.   Molecular weight distribution of black bean protease hydrolysates

图  3   超滤后各组分的α-葡萄糖苷酶抑制率

Figure  3.   α-glucosidase inhibition rates of each component after ultrafiltration

注：不同字母表示同一指标差异显著（P<0.05）。

图  4   LC-MS/MS总离子流色谱图

Figure  4.   Total ion flow chromatogram of LC-MS/MS

图  5   超滤Ⅰ组的肽段分子量分布

Figure  5.   Molecular weight distribution of peptide segments in ultrafiltration group I

图  6   3 种肽与α-葡萄糖苷酶（PDB ID：3WY1）相互作用的分子对接模型

Figure  6.   Molecular docking modeling of the interaction of three peptides with α-glucosidase (PDB ID: 3WY1)

注：A. FRY；B. KGLF；C. LKPF。

图  7   FRY、KGLF和LKPF的质谱图及化学结构

Figure  7.   Mass spectra and chemical structure of FRY, KGLF, LKPF

图  8   FRY、KGLF、LKPF和阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制率

Figure  8.   α-Glucosidase inhibition rates of FRY, KGLF, LKPF and acarbose

表  1   五种蛋白酶水解黑豆蛋白的最适水解条件

Table  1   Optimal hydrolysis conditions for five proteases to hydrolyze black bean protein

表  2   抑制率试验方法

Table  2   Inhibition rate test methods

注：“−”表示未添加。

表  3   双酶复合水解试验结果

Table  3   Results of dual-enzyme composite hydrolysis test

注：不同字母表示同一指标差异显著（P<0.05）。

表  4   黑豆蛋白及Ⅰ组的氨基酸含量

Table  4   Amino acid content of black bean protein and component I

注：EAA：必需氨基酸（Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、His、Lys）；HAA：疏水性氨基酸（Ile、Ala、Pro、Phe、Val、Leu、Trp、Met）；不同字母表示同一指标差异显著（P<0.05）。

表  5   15条黑豆蛋白肽的水溶性、毒性、疏水性及等电点

Table  5   Solubility, toxicity, hydrophobicity, and isoelectric point of 15 black bean protein peptides

表  6   黑豆蛋白肽与α-葡萄糖苷酶分子对接结果

Table  6   Molecular docking results of black bean peptides and α-glucosidase

本章节总结了通过双酶复合水解黑豆蛋白获得高抑制率酶解物，筛选出新型生物活性肽段，并通过分子对接验证其与-葡萄糖苷酶的结合机制，最终确定KGLF为高效抑制肽，为黑豆资源开发提供新思路，同时建议未来开展细胞或动物实验以进一步评估其应用潜力。

PART.03

思维导图

引用本文：周岚，李宏彬，孙嫚，等.  黑豆蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备及功能特性分析[J]. 食品工业科技，2025，46（24）：389−397. doi:  10.13386/j.issn1002-0306.2024110352.

Citation：ZHOU Lan, LI Hongbin, SUN Man, et al. Preparation and Functional Characteristics Analysis of Black Bean Protein α-Glucosidase Inhibition Peptide[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(24): 389−397. (in Chinese with English abstract). doi:  10.13386/j.issn1002-0306.2024110352.

通信作者简介

王长远，教授、博士生导师，黑龙江八一农垦大学党委常委、副校长，曾任黑龙江八一农垦大学食品学院院长。兼任黑龙江省食品与生物技术创新研究中心（国际合作平台）负责人、黑龙江省高校健康教育教学指导委员会专家、黑龙江省食品科学技术学会副理事长、中国食品科学技术学会预制菜专业委员会委员、中国农学会预制菜专业委员会等职。国务院政府特殊津贴专家，国家创新人才推进计划重点领域创新团队核心成员（第二）、黑龙江省头雁团队骨干成员，省级重点培育学科（食品科学与工程一级学科博士点）带头人。

主要研究方向：植物蛋白工程、功能性食品。主持国家重点研发计划项目课题、中央引导地方科技发展专项、自然基金等省内外研究课题20余项。获省科技进步二等奖3项、三等奖2项、中国食品科学技术学会科技创新奖——技术进步三等奖1项、中国轻工业联合会科技进步三等奖、中国发明协会发明创业一等奖、省高校科技进步一等奖1项、黑龙江农垦总局科技进步一等奖和三等奖等奖项。授权发明专利共34个。出版专著5部，发表论文130余篇。任《食品工业科技》编委及国内外多本期刊审稿专家。

曹荣安，博士，黑龙江八一农垦大学食品学院副教授，硕士生导师，韩国国立江陵原州大学获得博士学位，曾在加拿大和中国农业大学做访问学者。主要研究方向为天然生物活性产物，第一发明人获国家专利十余项（两项发明专利），申请专利二十余项，合作发明专利8 项。第一作者发表SCI、EI等学术论文二十余篇，主持完成课题5 项，主持在研课题3 项，参与课题研究十余项，课题获奖7 项。出版专著1 部，合作出版专著两部，主编和副主编教材各1 部，译著1 部，参编教材2 部，担任多个国内外期刊审稿专家。

（以上信息来自黑龙江八一农垦大学官网）