河北省重点研发计划|河北科技大学仪宏、张春晓：理性设计提高Blautia wexlerae的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶热稳定性

食品工业科技编辑部

2025-11-12

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本文获河北省重点研发计划项目（21372802D）；石家庄市科技计划项目（241490182A）；河北省发酵技术创新中心开放科研课题（重点类）。

河北科技大学食品与生物学院的冉凯旋, 荀明强，林凯欣, 付育, 王丽丽, 张春晓，仪宏等人重点介绍了D-阿洛酮糖的特性、应用价值及生物合成方法。D-阿洛酮糖是一种低热量稀有单糖，具有降血糖等健康功效，作为蔗糖替代品在全球市场快速增长。其生物合成主要依赖D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（DPE）催化果糖异构化，但现有DPE在工业条件下的热稳定性和耐酸性不足。本章提出通过理性设计改造一种新型来源于人体益生菌的DPE（WP_008708169.1），旨在提高其热稳定性，为工业应用和益生菌功能研究提供新思路。

摘要：为开发新的热稳定性高的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，本研究对肠道益生菌Blautia wexlerae基因组进行挖掘，对疑似D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中进行表达，应用高效液相色谱鉴定表达蛋白功能，通过理性设计提高该蛋白热稳定性。结果表明，B. wexlerae 糖磷酸异构酶基因具有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（DPE）功能，最适温度60 ℃，最适pH7.0，转化率27.1%±1.1%；突变体DPE（H283A）最适温度较野生型提高5 ℃，70 ℃下半衰期为30 min，较野生型半衰期延长10 min，转化率达30.6%±2.6%，较野生型提高3.5%。本研究挖掘并鉴定了B. wexlerae D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，理性设计获得了热稳定性和酶活力均提高的突变体DPE（H283A）。

PART.01

结果

1. 酶功能验证：通过序列比对（相似性>50%）和HPLC实验证实糖磷酸异构酶（WP_008708169.1）具有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（DPE）活性，可催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。

2. 理性设计提高热稳定性：联合Consensus Finder、Fireprot等软件预测35个突变位点，筛选出3个潜在稳定突变体（N130R、C269A、H283A）。分子动力学模拟（RMSD、Rg、RMSF）显示C269A和H283A突变体构象更稳定，其中H283A因新增氢键显著提升热稳定性。

3. 实验验证：突变体H283A最适温度提升至65℃，半衰期延长至30分钟（野生型20分钟），且在45–65℃保持80%以上酶活。H283A转化率提高3.5%（达30.6%），同时增强催化活性与热稳定性。

4. 工业适用性：该酶在pH6.0–7.0和Co²⁺/Mn²⁺存在时活性较高，适合工业环境。

5. 方法优势：理性设计结合计算分析有效减少实验工作量，优于传统易错PCR等高通量筛选方法。

图 1 比对不同来源的 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶氨基酸序列

Fig.1 Alignment of D-psicose-3-epimerase amino acid sequences from different sources

注：黑色、粉色、蓝色阴影氨基酸同源性为分别为 100%、75% 和 50%；菌株 A 为 Agrobacterium tumefaciens，菌株 B 为P. cichorii，菌株 C 为 R. cellulolyticum H10，菌株 D 为 E. bolteae ATCC BAA-613。

图 2 B. wexlerae 糖磷酸异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达

Fig.2 Expression of B. wexlerae glycophosphate isomerase in Bacillus subtilis

注：A：M：蛋白标准分子量；泳道 1 为 B. subtilis（pWB980）；泳道 2 为 B. subtilis（pWB-DPE）；B：M：蛋白标准分子量；泳道1 为野生型 DPE。

图 3 B. wexlerae DPE 反应液 HPLC 结果

Fig.3 HPLC results of B.wexlerae DPE reaction

注：A：D-果糖标准品；B：D-阿洛酮糖标准品；C：B. wexlerae DPE 反应液。

表 3 DPE 突变体预测结果

Table 3 Prediction results of DPE mutants

图 4 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶及突变体的 RMSD预测结果

Fig.4 RMSD prediction results of D-psicose-3-epimerase and mutants

图 5 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶及突变体的 Rg 预测结果

Fig.5 Rg prediction results of D-psicose-3-epimerase and mutants

图 6 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶及突变体的 RMSF 结果

Fig.6 RMSF results of D-psicose-3-epimerase and mutants

图 7 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体 SDS-PAGE电泳结果

Fig.7 Results of SDS-PAGE electrophoresis of D-psicose-3-epimerase mutants

注：M：蛋白标准分子量；泳道 1 为 B. subtilis（pWB980）；泳道 2为 B. subtilis（pWB-DPE（C269A））；泳道 3 为 B. subtilis（pWBDPE（H283A））。

图 8 DPE 野生型及突变体的酶学性质

Fig.8 Enzymatic properties of D-psicose-3-epimerase and its mutants at different temperatures

注：A：温度的影响；B：热稳定性；C：pH 的影响。

图 9 B. wexlerae DPE（WT）与 DPE（H283A）三维结构

Fig.9 3D structure of B. wexlerae DPE (WT) and DPE (H283A)

注：A：DPE（WT）；B：DPE（H283A）。

表 4 金属离子对酶活性的影响（%）

Table 4 Effects of metal ions on enzyme activity (%)

PART.02

结论

1. 发现糖磷酸异构酶（WP_008708169.1）具有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶功能。

2. 建立基于序列保守性和分子动力学的理性设计方法，成功获得热稳定性和酶活力提升的突变体DPE（H283A）。

3. 该方法可为其他酶的热稳定性改造提供参考。

4. 突变体DPE（H283A）耐高温和弱酸性环境，为工业制备D-阿洛酮糖奠定基础。

PART.03

思维导图

引用本文：冉凯旋，荀明强，林凯欣，等. 理性设计提高Blautia wexlerae的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶热稳定性[J]. 食品工业科技，2025，46（20）：192−201. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024110014.

Citation：RAN Kaixuan, XUN Mingqiang, LIN Kaixin, et al. Rational Design to Improve D-Psicose-3-epimerase Thermal Stability of Blautia wexlerae[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(20): 192−201. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024110014.

通信作者简介

仪宏，现任河北科技大学食品与生物学院教师，教授，硕士生导师，石家庄市人民政府智库特聘专家。工作30余年，致力于工业微生物、生物制造、合成生物学相关研究，在“十五”至“十二五”期间从事抗生素与维生素、厌氧发酵、液固分离等细分领域的研发与产业转化，“十三五”以后，致力于基因编辑、基因组防御等底层技术研究。主持承担多次科技部及河北省科技厅重点课题,为河北科技大学引入研究经费超过1000万元。科研成果转化后为企业和社会带来几千万经济效益。

张春晓，现任河北科技大学食品与生物学院教师，副教授，硕士生导师；河北省微生物学会会员；《生物学基础实验》虚拟教研室课程建设委员会会员。主要研究方向：酶工程、微生物代谢工程、植物组织培养。参研国家级项目5项，主持省级项目1项、参研2项；主持横向课题2项。在国内外期刊发表学术论文和科研论文30余篇，其中1篇被SCI收录，4篇被EI收录；授权专利2件。

（以上信息来自河北科技大学官网）

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