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入选中国科技期刊卓越行动计划
本文获国家重点研发计划(2022YFD1600403)。
摘要
为了提高枣皮槲皮素的稳定性与生物可及性,提高枣皮的附加值,本文从提取枣皮色素后的残渣中继续提取果胶,再以枣皮果胶和纤维素纳米晶(Cellulose Nanocrystals,CNC)为壁材对槲皮素进行包埋,通过单因素实验和响应面试验优化槲皮素微胶囊的制备工艺,采用环境扫描电镜(Environmental Scanning Electron Microscope,ESEM)、傅里叶红外光谱(Fourier-Transform Infrared Spectroscopy,FT-IR)、热重分析(Thermogravimetric Analysis,TGA)等方法对微胶囊进行表征,并研究其贮藏稳定性和体外模拟消化特性。结果表明,从色素残渣中提取果胶得率约为从枣皮中提取的11倍,优化后槲皮素微胶囊包埋率提升了15%以上,达到74.73%±2.45%。微胶囊呈无定形态,表面褶皱状,有明显凹痕,粒径为2.625±1.124 μm,多分散指数(Particle Dispersity Index,PDI)为0.286±0.163,微胶囊含水量为2.97%±0.40%。通过FT-IR和TGA分析结果显示复合壁材成功将槲皮素包封。在4 ℃和37 ℃下贮藏两周后微胶囊中槲皮素的保留率均比游离槲皮素高约20%,且包埋后的槲皮素生物可及性是游离槲皮素的2.5倍,实现了对槲皮素的有效包封和控释,增强了其稳定性并提高了其生物可及性。该研究为开发槲皮素相关产品及枣加工副产物枣皮的综合利用提供了理论基础。
枣皮是制作枣酒、枣汁等产品时红枣的副产物,每年约产生2000 t的枣皮,其含有丰富的酚类色素、果胶、纤维素等活性物质,但因其木质化、口感较差、无法被消化吸收而常被直接丢弃。富集并利用枣皮副产物功效成分,能够有效减少资源浪费并避免环境污染。从枣皮中提取的枣红色素由于其优良生物活性而表现出潜在的健康益处,从色素残渣中仍能够提取出具有良好胶凝性和稳定性的枣皮果胶。
作为枣皮色素中的主要活性物质,槲皮素(3,3’,4’,5,7-五羟基黄酮)是一种黄酮醇亚类化合物,在赋予食物颜色的同时,具有抗氧化、抗炎、提高免疫力等诸多对人体产生潜在健康益处的功效。与其他黄酮类化合物相比,槲皮素具有更强的抗自由基活性。日常食用富含槲皮素的食物不仅在维持机体心血管健康中发挥作用,还有助于预防机体免受自由基引起的癌症等疾病的侵害;2021年,Saeedi-Boroujeni等证实槲皮素是一种COVID-19的潜在抑制剂。由于其对人体的潜在健康益处,槲皮素已经成为食品和制药行业中不可或缺的植物营养成分。
槲皮素的化学结构和晶体形态导致其水溶性差(37 ℃时为23.02 mg/L),且在化学介质、高温和光照等条件下结构易发生变化、稳定性较差,从而导致其在胃肠道中容易发生自氧化和降解,影响其在到达靶器官时的生物利用度和生物活性,严重限制了其在功能性食品和药品中的进一步应用。包埋是一种提高槲皮素稳定性、功效和生物利用度的有效措施。微胶囊化可提高疏水性生物活性物质的溶解度和稳定性。槲皮素与其他载体联合使用在预防和治疗多种肿瘤方面取得了显著成果。Davoudi等设计了一种基于多孔淀粉和菊粉的载体来封装槲皮素,较单一材料多孔淀粉包封提高了槲皮素的封装效率(85.13%)、稳定性和生物活性,使槲皮素在体外消化中具有缓释和持续释放的效果。Valencia等开发了一种负载槲皮素的卵磷脂-壳聚糖纳米颗粒,包封效率高达98.31%,通过包封修饰表明电荷提高了槲皮素的溶解度,且制备的纳米颗粒具有较好的热稳定性、抗菌和抗氧化活性。
果胶和纳米晶纤维素(Cellulose Nanocrystals,CNC)作为包封材料的研究近年来受到广泛关注。果胶具有良好的生物相容性和成膜性,被广泛应用于药物和食品添加剂的包埋递送体系,从副产物枣皮中提取枣皮果胶将其用于包埋递送,可以更大程度发挥副产物的利用价值;同样CNC因其高机械强度和生物降解性,在食品保鲜和生物医药领域表现出优异的性能。果胶中的中性多糖、蛋白质和阿魏酸等组分通过疏水相互作用吸附在CNC表面,二者产生的协同乳化效果能够显著提高中链甘油三酯的包埋效率,具有保护敏感成分和提升产品功能性的作用。
本文以枣皮果胶和CNC为复合壁材、以槲皮素为芯材,利用喷雾干燥技术制备了槲皮素微胶囊,并对其稳定性及体外消化特性进行研究,旨在通过复合壁材间的协同稳定效果来实现槲皮素的稳态化,并达到持续释放和良好的控释目的,为槲皮素进一步在食品和医药领域的应用开发提供研究基础与思路,为加工副产物枣皮的综合利用提供理论依据。
结果与分析
芯壁材比例是影响槲皮素包埋率及微胶囊形态的关键因素之一。不同芯壁材比例对微胶囊的影响如图1所示,可以得出,当芯壁材比例1:5时为最佳,此时的包埋率为59.59%±1.54%。芯壁材比例过小时包埋率较低可能是由于芯材含量较低,部分复合壁材形成空微胶囊导致;而随着比例不断增大,乳化液中壁材占比越低时,形成微胶囊的壁变薄,甚至部分壁材没有完全包裹住槲皮素,导致在检测表面槲皮素含量的过程中溶出,使包埋率降低较为严重,且过高的芯壁材比例会影响喷雾干燥机的物料喷雾效果,导致包埋率降低。因此,选取芯壁材比例为1:4、1:5、1:6进行后续响应面试验。
图 1 芯壁材比例对槲皮素微胶囊包埋率的影响
Figure 1. Effect of core-wall material ratio on the encapsulation rate of quercetin microcapsules
注:不同小写字母的样品之间具有显著差异(P<0.05);图2~图4、图11同。
CNC作为壁材的重要组成,在乳化和喷雾干燥过程中反应体系的固含量,对微胶囊制备过程具有较大影响。CNC浓度对微胶囊包埋率的影响如图2所示,当CNC浓度为8 mg/mL时,槲皮素的包埋率最高(68.46%±1.05%)。CNC浓度过高或过低都会导致微胶囊包埋率降低。当浓度过低时,复合壁材中高果胶占比会导致乳化液黏度过高,在进料过程中阻力增大,在喷雾干燥过程中出现物料粘壁和喷嘴堵塞等现象,导致微胶囊粉末浪费和包埋率降低;此外,乳液中水分含量高会导致微胶囊水分含量增大,进一步导致了包埋率的降低。而CNC浓度过高时会出现微胶囊颗粒干燥不均匀和破裂等现象,这是由于微胶囊壁较厚使颗粒的内外干燥速率不同步导致。适宜的CNC浓度可以使微胶囊壁厚度适中,增强对芯材包埋的密封效果,从而提高包埋率。因此,选取CNC浓度为6、8、10 mg/mL进行后续响应面试验。
图 2 CNC浓度对槲皮素微胶囊包埋率的影响
Figure 2. Effect of CNC concentration on the encapsulation rate of quercetin microcapsules
果胶作为复合壁材的主要成分之一,因其高黏性具有增大包封效果的作用。果胶浓度对微胶囊包埋率的影响结果显示当枣皮果胶壁材浓度为5 mg/mL时微胶囊包埋率为最佳(69.79%±1.27%)(图3)。当浓度过低时,乳化液中壁材含量较低,导致芯材被包封效果变差,进而影响包埋率;而乳液中水分含量高会使喷雾干燥运行时间过长,增加能耗且效率低,长时间高温导致槲皮素降解。当浓度过高时,乳液中固含量和黏度均较高,相同进样流速下喷出的雾滴尺寸变大,可能导致干燥不充分和包封效果差的现象,从而影响包埋率。因此,选取枣皮果胶浓度为4、5、6 mg/mL进行后续响应面试验。
图 3 枣皮果胶浓度对槲皮素微胶囊包埋率的影响
Figure 3. Effect of jujube peel pectin concentration on the encapsulation rate of quercetin microcapsules
2.2.4 复合壁材溶液pH对槲皮素微胶囊的影响
溶液pH会影响果胶等壁材和槲皮素的溶解度、结构和稳定性,从而影响包埋率。壁材溶液不同pH对微胶囊包埋率的影响如图4所示,结果表明当壁材溶液环境为中性时,槲皮素的溶解性较弱,均质后会产生部分沉淀,从而导致微胶囊的包埋率较低。随着碱性环境逐渐增强,微胶囊的包埋率在pH为8时达到最大值,为73.07%±1.36%,此时弱碱性环境更利于槲皮素被壁材包封。碱性继续增强,枣皮果胶的胶凝度和溶解度均有一定程度的降低,从而导致包封效果变差,微胶囊的包埋率出现降低的趋势。
图 4 复合壁材溶液pH对槲皮素微胶囊包埋率的影响
Figure 4. Effect of pH of composite wall solution on the encapsulation rate of quercetin microcapsules
2.3 响应面试验优化喷雾干燥微胶囊的包埋率
2.3.1 响应面试验设计及结果
根据单因素实验结果,以槲皮素微胶囊的包埋率为响应值,选择对喷雾干燥包埋率影响较大的芯壁材比例、纤维素纳米晶浓度和枣皮果胶浓度三个因素作为自变量,使用Design-Expert 13软件,进行三因素三水平试验设计,响应面试验结果如表2所示。
表 2 响应面试验设计及结果
Table 2. Response surface experimental design and results
2.3.2 模型建立及显著性分析
运用Design-Expert 13软件对微胶囊包埋率试验结果进行方差分析,得到的二次多项式回归方程为:Y=74.75+1.27A+1.08B+1.21C+0.115AB+0.2675AC+0.105BC− 13.09A2−4.27B2−5.24C2。
由回归模型方差分析表3结果可知,模型的P<0.0001,说明模型极其显著;失拟项不显著(P=0.3377>0.05),表明方程拟合程度比较好;决定系数R2=0.9920,则说明实际值和预测值相关性较高。因此,该模型可以较好地反映喷雾干燥制备微胶囊过程中各因素与包埋率的关系并预测最佳制备工艺。所有二次项对微胶囊包埋率的影响为极显著,芯壁材比例、CNC浓度和果胶浓度对微胶囊包埋率的影响为显著,其余均不显著。由F值可知,三个因素对微胶囊包埋率的影响顺序为:A>C>B,即芯壁材比例>果胶浓度>CNC浓度。
表 3 回归方程系数显著性检验及方差分析
Table 3. Coefficient significance test and variance analysis of regression equation
注:*为差异显著(P<0.05);**为差异极显著(P<0.01)。
2.3.3 响应面分析
运用软件Design-Expert 13做出各因素之间交互作用对微胶囊包埋率影响的等高线及响应曲面图。如图5所示,响应曲面图在水平方向落下的投影是等高线,等高线若呈椭圆形,表示这两因素的交互作用对响应值的影响显著,若呈圆形则表示不显著,并且各因素响应曲面坡度的陡峭程度反映该因素对微胶囊包埋率的影响程度,坡度越陡峭,影响越大。综上,以上因素的两两交互作用对响应值的影响均不显著,且芯壁材比例对微胶囊包埋率的影响最明显,其次是果胶浓度,影响最小的是CNC浓度,与表3结论一致。
图 5 三因素之间交互作用对微胶囊包埋率影响的等高线图及响应面图
Figure 5. Contour plots and response surface plots of the effect of interaction among the three factors on microcapsule encapsulation rate
注:A1、A2为芯壁材比例与CNC浓度的交互作用对微胶囊包埋率的影响;B1、B2为芯壁材比例与枣皮果胶浓度的交互作用对微胶囊包埋率的影响;C1、C2为CNC浓度与枣皮果胶浓度的交互作用对微胶囊包埋率的影响。
2.3.4 最优工艺条件预测及验证
通过软件Design-Expert 13对实验数据进行优化预测,得到微胶囊最佳包埋率的配比芯壁材比例1:5.05、CNC浓度为8.26 mg/mL、果胶浓度为5.12 mg/mL,该条件下微胶囊包埋率的预测值为74.93%。结合实际操作,选取芯壁材比例1:5,CNC浓度为8.3 mg/mL,果胶浓度为5.1 mg/mL,制得的微胶囊包埋率为74.73%±2.45%,与预测值接近,较采用类脂蛋白包封槲皮素和通过复合凝聚法制备槲皮素微胶囊的包埋率明显提升,在此工艺下制备的微胶囊载药量达到14.78%±0.35%,较采用抗溶剂沉淀法和静电吸附法制备的槲皮素微胶囊显著提升。
2.4 槲皮素微胶囊的表征
2.4.1 粒度及水分含量表征
最佳制备工艺下制备的微胶囊的粒径为2.625±1.124 μm,PDI为0.286±0.163(图6),说明所制备微胶囊为微米级且粒径均一。此时,槲皮素微胶囊水分含量为2.97%±0.40%,保持在微胶囊水分含量的适当范围(约1%~5%)之间,有利于微胶囊具有良好的性能和贮藏寿命。当水分含量低于1%时,可能导致微胶囊过于干燥,结构较硬,活性成分药效减弱甚至失活;而当水分含量高于5%时,可能导致微胶囊结构软榻,且易于变形和粘连,影响微胶囊的稳定性和释放性能。
图 6 槲皮素微胶囊的粒径分布
Figure 6. Particle size distribution of quercetin microcapsules
2.4.2 形态观测
借助环境扫描电子显微镜观测通过喷雾干燥得到的微胶囊粉末和槲皮素粉末的形态结构。如图7A所示,游离槲皮素在ESEM下呈大小不均匀的棒状结构,大小在5~20 μm范围内。通过喷雾干燥制备的槲皮素微胶囊呈无定形状态,表面褶皱,有明显凹痕,粒度为1~4 μm,与粒度仪测定结果一致,且在微胶囊ESEM图中也能看到部分未完全被复合壁材包裹住的槲皮素(图7B~图7C)。微胶囊表面的不规则褶皱可能是由于喷雾干燥机的高入口温度导致壁材迅速蒸发形成;也可能是由于扫描电镜运行时对微胶囊施加真空压力,导致其凹陷坍缩,且在某些应用中,粉末表面的不规则性有助于微胶囊更好的分散性和再水化能力。从图7C可以看出喷雾干燥微胶囊表面没有明显裂痕,证明复合壁材的包封效果较好。
图 7 槲皮素与微胶囊的ESEM
Figure 7. ESEM diagram of quercetin and microcapsules
注:A.槲皮素(16000×);B.微胶囊(10000×);C.微胶囊(40000×)。
2.4.3 傅里叶变换红外光谱
利用傅里叶红外光谱仪分别对通过喷雾干燥得到CNC粉末、枣皮果胶粉末、复合壁材粉末、槲皮素粉末及微胶囊粉末进行测定,结果如图8所示。图中虚线标注,透射波段出现在935、1020、1320、1520 cm−1归因于芳香族化合物,分别代表着芳香族弯曲、苯环上C-H伸缩振动、芳香族C-O拉伸和苯环键伸展,这些槲皮素的特征峰出现在微胶囊中,峰强度变弱甚至消失,表明槲皮素被复合壁材所包裹。图中1060 cm−1处为CNC的特征峰,是C-O-C伸缩振动峰。对于微胶囊的红外光谱,在相应位置均具有明显的复合壁材和槲皮素的特征峰,且微胶囊红外峰形除微小峰振动外,与复合壁材峰形保持基本一致,没有观察到新的特征峰。表明这些材料通过氢键和疏水相互作用等非共价键和物理吸附相互作用实现了包封槲皮素。
图 8 微胶囊、槲皮素和复合壁材的傅里叶变换红外光谱结果
Figure 8. Fourier transform infrared spectra of microcapsules, quercetin and composite wall material
2.4.4 热重分析
利用热重分析仪分别对通过喷雾干燥得到CNC粉末、枣皮果胶粉末、复合壁材粉末、微胶囊粉末及槲皮素粉末进行测定,结果如图9所示。150 ℃前的失重归因于物质中游离水和结合水的损失。第二阶段失重出现在150~350 ℃,是晶体结构和有机成分的热分解导致,与聚合物的分子链分解和降解有关。温度高于400 ℃,样品的失重逐渐减少,可能是由于碳酸化反应所致。在第二阶段微胶囊受热分解温度与复合壁材相差不大,低于槲皮素分解温度,热稳定性较槲皮素差,可能是由于微胶囊受热外层壁材先发生热分解,且微胶囊在第三阶段微胶囊热分解较复合壁材更严重,能够说明槲皮素被壁材包裹形成微胶囊。
图 9 微胶囊、槲皮素和复合壁材的热重分析
Figure 9. Thermogravimetric analysis of microcapsules, quercetin and composite walls
注:A. TGA;B. DTG。
2.5 槲皮素微胶囊的贮藏稳定性
槲皮素分子结构中含有多个羟基,是其发挥生物活性成分的位点,但也是其不稳定性的原因。本研究将槲皮素包埋在微胶囊中,并对比了微胶囊化对槲皮素在不同贮藏条件下稳定性的影响。如图10所示,在4 ℃避光条件下贮藏14 d后游离槲皮素损失了31.23%±2.46%,而微胶囊中槲皮素仅损失了10.18%±1.56%,与以多孔淀粉-菊粉包埋的微胶囊在相同条件下的槲皮素保留率相当,均能够较好地对槲皮素起保护作用;在37 ℃避光条件下,47.39%±1.78%的游离槲皮素发生了降解,而微胶囊中槲皮素仅损失了28.53%±2.78%。可以看出微胶囊中槲皮素贮藏14 d后的保留率远高于游离槲皮素。这可能是微胶囊表面复合壁材对槲皮素起到保护作用,能够控制其释放,以减少其在贮藏期间的降解。贮藏稳定性结果表明,通过微胶囊处理能够有效提高槲皮素的稳定性,为其进一步在食品中广泛应用提供了基础。
图 10 槲皮素和微胶囊的贮藏稳定性
Figure 10. Storage stability of quercetin and microcapsules
2.6 槲皮素微胶囊的体外消化特性
2.6.1 微胶囊释放特性
在模拟胃肠消化过程中槲皮素的释放特性如图11所示,微胶囊中的槲皮素被缓慢释放。在胃消化的第1 h,56.81%±2.48%的槲皮素从微胶囊中释放,这是由于部分槲皮素在微胶囊表面吸附,随着胃消化的继续,槲皮素释放趋于缓慢。经过2 h的胃消化阶段,微胶囊中槲皮素累积释放率为59.15%±2.15%。进入肠消化阶段,槲皮素进一步从微胶囊中大量释放,第1 h时释放率达到29.79%±2.36%,这归因于果胶壁材中的羧基在胃液酸性环境下被质子化,较难溶于水,保护微胶囊免受胃蛋白酶的消化,而水溶性复合壁材容易被胰酶水解,使得微胶囊中的槲皮素在肠液中得到持续释放;也可能是酸碱环境的突变导致静电斥力和亲水性的变化,促进了槲皮素在肠液中的释放。经过3 h的肠道消化期后,微胶囊中槲皮素累积释放92.74%±1.08%。结果表明微胶囊在模拟胃肠消化条件下具有良好的控释和持续释放槲皮素的效果。
图 11 体外消化过程中槲皮素的累积释放率
Figure 11. Cumulative release rate of quercetin during in vitro digestion
2.6.2 体外消化过程中的槲皮素生物可及性
经过长时间高强度离心后,需要通过胶束层中槲皮素含量来判断槲皮素的生物可及性。游离槲皮素与微胶囊中槲皮素的生物可及性如图12所示。可以看出游离槲皮素经过5 h的模拟消化后,生物可及性仅为19.04%±1.27%,这可能是由于游离槲皮素的低溶解性使其在消化结束时仍有部分沉淀,这很大程度上限制了游离槲皮素的生物可及性;而通过复合壁材将槲皮素包封形成微胶囊,不仅提高了槲皮素的溶解性,还能够将颗粒中的槲皮素在消化阶段缓慢释放,使更多的槲皮素溶于胶束中,进而提高了槲皮素的生物可及性,达到游离槲皮素的2.5倍,为46.38%±2.50%。
图 12 体外消化过程中槲皮素的生物可及性
Figure 12. Bioaccessibility of quercetin during in vitro digestion
Citation: YANG Jiwen, SUO Xiaoyi, ZHANG Ziyi, et al. Construction, Stability and in Vitro Digestive Properties of Quercetin Microcapsules[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(24): 259−268. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024090369.
通讯作者简介
桑亚新,男,1972年出生,河北农业大学副校长,食品科技学院教授、博士生导师,日本筑波大学访问学者。教育部食品科学与工程专业教指委委员,中国食品科技学会第二届青年委员,河北省食品学会秘书长,河北省海洋学会常务理事,国家食品安全管理体系(HACCP)审核专家,国家注册有机食品审核员。担任《Journal of Agricultural and Food Chemistry》《Food Microbiology》《Food Control》《Modern Food Science and Technology》等多个学术期刊的审稿人。已从事食品科研、教学和生产一线工作20余年,主要研究方向为:农副产品综合加工利用、益生菌与益生元和食品微生物等领域。获得省级科技进步一等奖3项,省级二等奖和三等奖各1项,国家教学成果二等奖和河北省教学成果一等奖各1 项,市厅级奖励30余项;主持国家“十四五”重点研发计划“乡村产业共性关键技术研发与集成应用”专项——特色干果产业关键技术研究与应用示范(项目编号2022YFD1600400),主研“十三五”重点研发计划“食品安全关键技术研发”专项——“重要食品真实性多维鉴别检测关键技术研究”子课题“食品产地精准溯源技术研究”和“食品内源性身份特征甄别技术研究”;主持国家“十二五”公益性行业科研专项——贝类副产物加工利用共性关键技术研究(NO.200805046-4)和扇贝对虾副产物综合利用关键技术研究与中试(NO.201205031-0105),其他省部级科研项目20余项,主编“食品微生物学”等教材专著10余部,发表高水平论文70余篇,申请国家发明专利20余项,获得国家发明专利8项,转化2项。
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