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入选中国科技期刊卓越行动计划
本文获国家重点研发计划（2022YFC2104900）。
摘要
目的：发掘耐热木聚糖酶并探究其在麦芽糖化中的应用潜力。方法：克隆嗜热拟青霉（Paecilomyces thermophila）J18木聚糖酶（PtXynA）基因，将其在黑曲霉中进行异源表达，在5 L发酵罐中采用液体深层发酵制备重组酶（PtXynA），进一步探究酶的酶学性质，最后评价重组酶在麦芽糖化中的应用效果。结果：重组菌经液体深层发酵96 h后，木聚糖酶的酶活力达到904.0 U/mL，蛋白含量为1.4 mg/mL。重组酶在pH7.0和70 ℃下表现出最高酶活力，在pH5.5~9.0和75 ℃以下保持稳定。PtXynA显示出严格的底物特异性，对小麦阿拉伯木聚糖（1993.2 U/mg）的比酶活力最高，其次为燕麦木聚糖（1782.5 U/mg）、榉木木聚糖（1552.0 U/mg）和桦木木聚糖（1238.7 U/mg）。在麦芽糖化过程中添加木聚糖酶（200 U/g麦芽），麦芽汁的过滤时间和黏度分别降低了43.9%和10.8%。结论：PyXynA具有优良的酶学特性，在啤酒糖化过程中显示出较大应用潜力。
木聚糖酶（EC 3.2.1.8）是一类木聚糖水解酶，能够催化水解木聚糖分子内部的β-1,4-糖苷键，释放出低聚木糖（Xylooligosaccharides，XOS）和木糖。基于氨基酸序列相似性，木聚糖酶可以划分为不同的糖苷水解酶（Glycoside hydrolase，GH）家族，包括GH 5、8、10、11和30，其中来源于GH 11家族的木聚糖酶研究的最多和最为深入。木聚糖酶可广泛应用于XOS生产、面制品、烘焙食品、酿酒及果汁澄清等众多食品领域。微生物是木聚糖酶的主要来源，但是天然微生物产木聚糖酶产量一般偏低，生产成本相对较高，无法满足工业化生产的需要。采用生物工程技术异源表达是提高木聚糖酶产量的重要途径之一。黑曲霉（Aspergillus niger）是最常用的丝状真菌表达宿主，已被美国食品与药品监管局（FDA）定义为GRAS（Generally recognized as safe），同时，黑曲霉还具有pH（2.0~11.0）和温度（10~50 ℃）稳定性好、环境适应性强等优点。然而，由于其遗传背景复杂，目前在黑曲霉中成功表达的木聚糖酶种类仍然十分有限，且酶活力普遍较低。
麦芽糖化是啤酒酿造过程中的一个重要工序。阿拉伯木聚糖是麦芽中主要的非淀粉多糖之一，在麦芽糖化过程中会导致麦芽汁的黏度过高，引起滤膜堵塞，从而影响啤酒的颜色和外观。因此，降低麦芽汁中阿拉伯木聚糖的含量或降低其分子量（降低黏度），对于提高啤酒的生产效率和质量具有重要的意义。阿拉伯木聚糖酶能够特异性水解阿拉伯木聚糖，将其降解为低黏度小分子或低聚糖，在麦芽糖化中具有潜在的应用价值。通常，在啤酒糖化工艺中，麦芽汁需要在70 ℃下保温1 h确保糖化完全，因此对木聚糖酶的热稳定性要求较高。目前，虽然已有部分阿拉伯木聚糖酶的研究报道，但是高活力耐热型阿拉伯木聚糖酶的报道相对较少，如毛壳霉（Chaetomium sp.）、樟绒枝霉（Malbranchea cinnamomea）和嗜热拟青霉（Paecilomyces thermophila）木聚糖酶等。因此，继续发掘具有高阿拉伯木聚糖酶活力的耐热木聚糖酶，对于提升麦芽糖化的效率具有重要的意义。
在实验室前期研究中，筛选得到一株丝状真菌——嗜热拟青霉J18，从中发掘了一种耐热木聚糖酶（PtXynA）并成功将其在毕赤酵母中进行了异源表达。为推进该酶在食品工业生产中的实际应用，本研究进一步构建了食品安全级黑曲霉表达系统，将该木聚糖酶基因在黑曲霉中进行了异源表达，探究了重组酶的酶学性质，并评价了该酶在麦芽糖化中的应用效果。
结果与分析
以嗜热拟青霉的cDNA为模板，通过特异性引物PtxynAF和PtxynAR成功扩增出PtxynA基因序列。扩增得到的序列通过吉布森组装成功连接到表达质粒上，得到表达载体Blunt-pryG-PtxynA（图1a）。PtXynA基因全长为678 bp，编码226个氨基酸。对在CD高渗平板上生长的转化子设计验证引物，菌落PCR结果显示成功从转化子中提取得到木聚糖酶基因（PtXynA）（图1b）。对测序正确的转化子发酵6 d后，上清液中木聚糖酶活力最高为168 U/mL（图2）。挑选木聚糖酶活力最高的转化子用于后续液体深层发酵。
图 1 PtXynA的表达载体图谱（a）和阳性转化子PCR扩增产物（b）
Figure 1. Expression vector map of PtXynA (a) and PCR amplification products of positive transformants (b)
注：M：标品；1~5：部分PtXynA阳性转化子扩增产物。
图 2 不同转化子发酵上清液木聚糖酶活力
Figure 2. Xylanase activity in the supernatant of fermentation of different transformants
液体发酵96 h时，发酵上清液中木聚糖酶活力最高，达到904.0 U/mL，此时蛋白浓度为1.4 mg/mL（图3）。PtXynA经QSFF强阴离子交换层析柱纯化后得到电泳级纯酶（图4），酶活力回收率为81%。该酶在电泳图上显示为一条清晰条带，分子量约为24.6 kDa（图4）。PtXynA纯酶的比酶活力提高到1254 U/mg。
图 3 重组黑曲霉液体深层发酵产PtXynA发酵过程
Figure 3. Fermentation process of PtXynA produced by liquid deep fermentation of recombinant A. niger
图 4 木聚糖酶PtXynA纯化电泳分析
Figure 4. SDS-PAGE analysis of proteins during the purification process of PtXynA
注：泳道M：低分子量标准蛋白；泳道1：粗酶液；泳道2：纯酶液。
目前，已经有许多木聚糖酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中实现了异源表达。黑曲霉作为一种食品安全的丝状真菌，也常被用作异源表达宿主。然而，由于其遗传背景的复杂性，目前在黑曲霉中成功表达的木聚糖酶种类仍然十分有限。PtXynA在5 L发酵罐中经96 h深层发酵后，木聚糖酶活力达到904 U/mL，这一产量高于其他部分丝状真菌表达的木聚糖酶，如来源于葡萄穗菌（Stachybotrys chartarum）的木聚糖酶在黑曲霉中异源表达，比酶活力为392 U/mg。Decelle等将来源于黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chyrsoporium）的三个木聚糖酶基因在黑曲霉中表达，酶活力分别为0.47、1.22和3.17 U/mL。此外，PtXynA的发酵酶活力也高于部分在毕赤酵母中表达的木聚糖酶，如来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的木聚糖酶XynA（33.7 U/mL）和来源于镰刀菌（Fusarium oxysporum）Fo47的木聚糖酶FXYL（779.64 U/mL）。
图 5 PtXynA的最适pH（a）、最适温度（b）、pH稳定性（c）、温度稳定性（d）及半衰期（e）
Figure 5. Optimal pH (a), optimal temperature (b), pH stability (c), thermal stability (d) and thermal denaturing half-lives (e) of PtXynA
优良的酶学性质是木聚糖酶能否工业化应用的前提。PtXynA在pH5.5~9.0范围内保持稳定，这一稳定范围比多数其他来源木聚糖酶要宽，如瘤胃宏基因组（Rumen metagenome，pH4.0~7.0）、北方炭疽菌（Colletotrichum boninense，pH4.0~6.0）以及链霉菌T7（Streptomyces sp. T7，pH5.0~8.0）木聚糖酶。较宽的pH稳定性范围使PtXynA能够更好地应对反应体系中pH的波动，提高其应用适应范围。热稳定性是影响木聚糖酶工业应用的另一个重要因素。较高的耐热温度不仅有利于提高酶催化反应速度，提高生产效率，而且还可有效避免反应过程中杂菌的污染。此外，某些应用场景更是需要耐热性优良的特异性木聚糖酶，例如麦芽糖化和烘焙食品加工中。研究表明，相同的基因在不同表达系统中展现的酶学性质有所差异，这可能是由于不同表达宿主会进行不同的蛋白修饰，如糖基化。PtXynA在黑曲霉中表达展现出更好的热稳定性，在≤75 ℃时保持稳定，70 ℃下的半衰期达到211 min（图5）。这一特性显著优于目前已报道的多数青霉属木聚糖酶，如变异拟青霉（P. variotii）木聚糖酶在60 ℃下保持稳定，同属于变异拟青霉ATHUM 8891的木聚糖酶在65 ℃下保持稳定，铜绿拟青霉（P. aerugineus）木聚糖酶在55 ℃下保持稳定。但PtXynA的热稳定性仍然低于其他几种极端嗜热菌来源木聚糖酶，如海栖热袍菌（Thermotoga maritima）耐热木聚糖酶TmXyn10B（90 ℃下保持稳定）等。
PtXynA表现出严格的木聚糖底物特异性，其中对小麦阿拉伯木聚糖的比酶活力最高（1993.2 U/mg），其他依次为燕麦木聚糖（1782.5 U/mg）、榉木木聚糖（1552.0 U/mg）和桦木木聚糖（1238.7 U/mg）。该酶对其他测试的非木聚糖类底物没有显示出水解活性（表2）。
表 2 PtXynA的底物特异性
Table 2. Substrate specificity of PtXynA
注：PtXynA对CMC、大麦葡聚糖、刺槐豆胶、可溶性淀粉和几丁质没有水解活性。
阿拉伯木聚糖由于在其分子骨架上存在大量阿拉伯糖基侧链，通常会阻碍普通木聚糖酶对其主链分子的水解，导致水解效率降低。本研究中的木聚糖酶PtXynA对小麦阿拉伯木聚糖具有较高的比酶活力。目前仅有少数木聚糖酶对阿拉伯木聚糖表现出较高的水解活性，例如毛壳霉木聚糖酶CsXynAop（1850 U/mg）、镰刀菌属21（Fusarium sp.）木聚糖酶（456 U/mg）和海栖热袍菌木聚糖酶（1565 U/mg）。PtXynA对小麦阿拉伯木聚糖的高水解活性，使其在麦芽糖化、面包等富含阿拉伯木聚糖的食品生产中具有重要的应用潜力。
图 6 PtXynA的三维结构模拟图
Figure 6. Simulation of three-dimensional structure of PtXynA
注：a：PtXynA三维结构，两个催化氨基酸呈现棒状；b：PtXynA（金色）和EnXyn11A（蓝色）的结构叠加；c：PtXynA和EnXyn11A催化中心高度的比较；d：PtXynA和EnXyn11A催化区域氨基酸变化比较。
为了揭示PtXynA高阿拉伯木聚糖底物特异性的内在机制，将其结构与典型的GH 11家族木聚糖酶EnXyn11A的底物复合物结构（PDB 2vgd.1）进行了叠加分析。通过比较发现，PtXynA与其他GH11家族木聚糖酶的底物结合位点上存在显著差异：PtXynA的底物结合位点可以容纳6个木糖单位（图6b），而其他大多数已报道GH 11家族木聚糖酶的底物结合位点一般仅可容纳5个木糖单位。比较催化中心的高度和氨基酸序列发现，PtXynA（5.9 Å）的催化区高度明显高于EnXyn11A（4.0 Å）（图6c），更高的催化区域可能更有利于酶与带有侧链的木聚糖结合，进而赋予PtXynA更高的阿拉伯木聚糖催化活力。通过二者催化区域附近的氨基酸比较，可以发现EnXyn11A的三个疏水氨基酸（Val127、Ala136和IIe133）对应于PtXynA的两个亲水氨基酸（Gln144和Asp141）和一个疏水氨基酸（Tyr135）（图6d）。木聚糖酶催化区内亲水氨基酸与酶催化活性高低密切相关。如Boonyapakron等对木聚糖酶X11进行了随机突变，发现71位疏水性苯丙氨酸（Phe）突变为亲水性苏氨酸（Thr）后，突变酶酶活力相较野生型提高了15.9倍。
在模拟糖化条件下，PtXynA添加量在200 U/g麦芽时，麦芽汁的过滤时间降到最低，相比对照下降了43.9%，同时黏度下降了10.8%，之后随着加酶量的继续提高，麦芽汁过滤时间和黏度没有出现明显提高（表3）。
表 3 PtXynA在麦芽糖化工艺中对麦芽汁过滤时间和黏度的影响
Table 3. Effect of PtXynA on the filtration time and viscosity of wort in the malting process
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Citation:YANG Hang, ZHANG Wenjiao, YAN Xiemin, et al. Heterologous Expression of a Thermostable Arabinoxylan Specific Xylanase from Paecilomyces thermophila and Its Application in Malt Mashing[J]. Science and Technology of Food Industry, 2026, 47(1): 189−196. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024100013.
通讯作者简介
闫巧娟，博士，教授，教育部新世纪优秀人才，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心岗位科学家。1997年硕士毕业于中国农业大学食品学院后留校任教，2004年晋升副教授，2009年晋升教授。长期从事农产品生物转化方面的科学研究,主要在食品相关酶制剂及其水解产物、功能性低聚糖、天然功能成分和微生物产有机酸等方面开展工作。近十年来，在木聚糖酶、葡聚糖酶、半乳糖苷酶和甘露聚糖酶等的产酶菌株筛选、基因克隆表达、酶的结构解析和分子改造、酶的纯化和性质及水解特性方面开展深入研究，得到多个性能优良的新型酶。主持完成国家863计划、国家自然科学基金项目等20多项。发表学术论文150余篇，其中SCI收录论文100余篇；授权国家发明专利40余项。获国家科技进步二等奖3项和省部级奖励3项。
杨绍青，男，土家族，中共党员，1980年生，湖北省来凤县人，博士，中国农业大学食品科学与营养工程学院教授、博士生导师，国家优秀青年科学基金获得者。本科毕业于长江大学，2008年获中国农业大学博士学位，历任浙江工商大学讲师、香港理工大学博士后，2011年入职中国农业大学，2019年晋升教授。现任北京市“高精尖”创新中心岗位科学家、中国生物发酵产业协会益生制品分会副秘书长。
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