北京工商大学：多粘菌素B抑制丝状真菌的定量测定方法研究- 大数跨境

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北京工商大学：多粘菌素B抑制丝状真菌的定量测定方法研究

食品工业科技编辑部

2020-05-29

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抗菌肽（Antimicrobial peptides, AMPs）是一类具有抗菌生物活性小分子多肽物质的总称，具有抑制或杀灭细菌、真菌以及病毒、肿瘤的能力。天蚕素是发现的第一个小分子抗菌肽，此后，相继从昆虫、植物、微生物，包括人体中发现了2000多种抗菌肽。研究发现，抗菌肽具有抑菌谱广、抑菌活性高、性质稳定、不易产生耐药性等优良特性，作为抗生素的良好替代品已引起人们极大关注。

目前市面上抗菌肽产品种类众多，但被批准使用的较少，其中乳酸链球菌素已被批准用于食品防腐剂，短杆菌肽S、多粘菌素B和林蛙抗菌肽可用于制造皮肤软膏，那西肽在欧盟和日本被批准用于饲用添加剂。抗菌肽应用前首先要进行功效评价，然而，由于其来源广泛、结构多样、差异较大，致使其评价方法众多。在活力评价方面，抗菌肽尚未形成统一的评价体系或标准方法，导致其定量测定方法不统一，产品良莠不齐、缺乏可比性，因此亟需建立和完善抗菌肽的活性测定方法，并制定相关的标准，以保证抗菌肽产业的健康发展。

在方法建立过程中一般采用标准物质进行研究，针对本研究而言，主要考虑的是抗菌肽和指示菌。市面上销售的抗菌肽产品种类众多，但是目前常用作标准物质的有乳酸链球菌素、那西肽、杆菌肽、短杆菌肽、多粘菌素等。文献报道显示，对真菌具有抑制作用的抗菌肽有微生物源抗菌肽（杆菌肽、短杆菌肽S和多粘菌素B）、昆虫类抗菌肽（天蚕素、昆虫防御素）以及鱼类、两栖类及哺乳动物类抗菌肽。其中报道较多、使用较广的为微生物源抗菌肽——杆菌肽、多粘菌素B。多粘菌素B对真菌和革兰氏阴性菌均可以产生较好抑菌效果，杆菌肽对真菌的抑制作用稍弱于革兰氏阳性细菌，短杆菌肽S对真菌和革兰氏阳性菌的抑制作用较好，但近年短杆菌肽S的应用逐渐减少。

在抗菌肽抑制真菌中，研究较多的是对植物病原菌的抑制，其指示菌一般选择镰刀菌、立枯丝核菌等，但对引起食品和谷物腐败或霉变的霉菌研究较少，本研究选择常用的真菌指示菌——黑曲霉和青霉。由于抗菌肽对真菌的抗菌方式各不相同，所选的指示菌应具有一定代表性，一般选择标准菌株或质控菌株，综合考虑，以下研究选用标准菌株A. niger ATCC 16404和P. chrysogenum ATCC 10106作为指示菌。

在丝状真菌生长培养基的选择中，文献报道大部分采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和察氏培养基，考虑PDA培养基为天然原料，制备时成分不稳定，而察氏培养基为化学合成原料，成分稳定，因此，测定方法标准化时考虑重现性等问题，本研究优先选择察氏培养基作为丝状真菌生长的培养基。因此，北京工商大学贾英民教授团队以多粘菌素B为抗菌肽研究对象，以黑曲霉和产黄青霉为指示菌，通过比较孢子萌发抑制法和菌丝生长抑制法筛选抗菌肽抑制丝状真菌的定量测定方法，并进一步优化该方法的最适测定条件，为解决抗菌肽评定指标不统一、评价方式混乱等问题奠定基础。

多粘菌素B抑制丝状真菌的定量测定方法研究

王志新¹，李昌旺¹，宏丹¹，宁亚维¹，贾英民^2,*

（1. 河北科技大学生物科学与工程学院，河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050018；

2. 北京工商大学食品学院，北京 100048）

目的：为规范抗菌肽抑制丝状真菌的活力评价方法。

方法：采用多粘菌素B为抗菌肽研究对象，以黑曲霉（Aspergillus niger ATCC 16404）和产黄青霉（Pencillinm chrysogenum ATCC 10106）为指示菌，选用察氏培养基（20 mL培养基/90 mm平板）比较孢子萌发抑制法和菌丝生长抑制法，获得适合丝状真菌的测定方法，并进一步研究该方法的最适测定条件。

结果：菌丝生长抑制法更适用于多粘菌素B抑制2株丝状真菌的定量检测。其中多粘菌素B抑制Aspergillus niger ATCC 16404的最适条件：指示菌培养48 h，接种菌饼直径（8.00±0.02）mm，在此条件下，测得多粘菌素B的EC50为0.68 mg/mL；多粘菌素B抑制Pencillinm chrysogenum ATCC 10106的适宜条件：指示菌培养72 h，接种菌饼直径（5.80±0.02）mm，此时多粘菌素B的EC₅₀为0.45 mg/mL。，菌丝开始生长，逐渐向菌饼四周延伸，随着菌丝的生长，形成的菌落圆且边缘整齐，易于菌落直径的测量。