江苏大学：牛乳铁蛋白肽衍生肽结构设计及其在毕赤酵母中表达后的活性分析

牛乳铁蛋白肽（Bovine Lactoferricin，LFcinB）是牛乳铁蛋白在酸性环境下，经胃蛋白酶水解得到的长25个氨基酸残基的小分子生物活性肽，具有多种生物活性，在已发现的人、山羊、牛、骆驼、鼠等哺乳类动物乳铁蛋白肽中，LFcinB抗菌活性最高，对四种肠出血性大肠杆菌的抑制活性比牛乳铁蛋白高300~350倍。LFcinB具有良好的耐热性、非抗原性、免疫调节活性、广谱抗菌和抗病毒活性，可广泛作为食品防腐剂、抗氧化剂、营养添加剂等。LFcinB分子量3126.4 Da，相对疏水性48%，电荷数+8。抑菌过程中，LFcinB两亲性结构与膜脂多糖相结合，疏水残基与膜的亲脂部分相互作用，使细胞膜形成穿孔，细胞内容物外泄起到抑菌杀菌作用，且不产生耐药性。目前抗生素耐药性的威胁已经亟需控制，新的抗菌性药物寻找已迫在眉睫，LfcinB无耐药性特点表明LfcinB是极具潜力的抗菌药物。由于天然来源有限，酶解分离困难，化学合成成本高昂，因此利用基因工程技术生产LfcinB已经成为研究和发展趋势。

近年来，研究人员致力于抗菌肽结构与功能关系的研究，以期通过对抗菌肽结构的改变（两亲性参数，净电荷数，疏水性参数）获得具有更高抗菌活性的衍生肽。江苏大学王亮研究员团队根据抗菌肽数据库和生物信息学分析，首先对不同物种来源的乳铁蛋白肽序列进行同源性分析，确定LFcinB的非保守氨基酸位点。其次针对非保守氨基酸位点进行了替代性分析，优化设计出LfcinB-W4。合成LFcinB-W4序列基因后根据多克隆位点构建至外泌型表达载体pPIC9K中，构建的重组表达载体为pPIC9K-LFcinB，电转化至毕赤酵母GS115后，使用甲醇作为诱导剂诱导LFcinB-W4表达，以期获得具有高抗菌活性的衍生肽。

方法：本研究通过抗菌肽数据库和生物信息学等工具对牛乳铁蛋白肽衍生肽（LfcinBD）的结构进行优化设计，将衍生肽LfcinB-W4的基因片段在毕赤酵母GS115表达。

重组表达载体pPIC9K-LFcinB-W4构建

Construction of recombinant vector pPIC9K-LFcinB-W4

结果：发酵实验结果表明，当甲醇诱导浓度为2.5%，发酵时间为96 h时，发酵上清液对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌具有很强的抑制作用，其效果与50 mg/mL的氨苄青霉素抑菌效果相当，高于LFcinB。发酵上清液冷冻干燥浓缩后，10倍的发酵上清浓缩液其抑菌效果为同体积50 mg/mL的氨苄青霉素的2.5倍。

不同甲醇浓度诱导对发酵上清液表达活性的影响

Effect of induction of different methanol concentration on the expressionactivity of fermentation supernatant

注：1～5：2.0%-4.0%甲醇浓度；6：阴性对照；A：阳性对照。

  pPIC9K-LFcinB-W4测序

DNA sequencing of pPIC9K-LFcinB-W4                                

结论：实验通过生物信息学工具设计得到抑菌活性高于LFcinB的衍生肽，为下一步分析牛乳铁蛋白肽功能与结构关系奠定了基础。