本文基于高效液相色谱法，通过优化色谱条件和样品前处理条件，建立了一种测定β-烟酰胺单核苷酸（NMN）胶囊和NMN片剂基质中NMN含量的检测方法，并进行方法学验证。结果表明，本方法在5~500 μg/mL范围内有较好的线性关系，方法检出限（LOD，S/N=3）为1.0 mg/kg，定量限（LOQ，S/N=10）为3.0 mg/kg，仪器精密度为0.3%。对于NMN片剂样品，方法稳定性为1.7%，重复性为1.8%；对于NMN胶囊样品，方法稳定性为0.6%，重复性RSD值0.6%。NMN片剂和NMN胶囊样品中NMN的检测回收率在90.9%~108.9%之间，相对标准偏差均不超过1.9%。综上，本方法具有较好的重现性、精密度、稳定性、重复性，结果准确可靠，可用于实际样品中NMN含量的准确测定。通过对6种市售的NMN产品进行检测，所有样品中均检出了NMN，但是部分产品的实际含量较其标称含量偏少，发现部分产品存在虚报NMN含量的问题。
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齐齐哈尔大学的张文宇、中国标准化研究院的兰韬*、云振宇*等通过优化样品的前处理方法和液相色谱方法，开发胶囊、片剂等剂型NMN跨境产品中NMN含量开发相应的检测方法，并通过方法学验证，为建立相应的检测方法标准奠定方法学基础，对于提高NMN相关产品质量，促进相关产业的便捷监管具有深远意义。
1 液相色谱条件优化
经查阅文献，研究者们通常采用反相C18色谱柱来实现NMN的分离，但由于NMN的极性较大，几乎没有保留，出峰时间过早，容易与样品基质峰发生混淆。所以本文考虑使用对于极性样品分离效果较好的HILIC色谱柱进行样品的分离。
为尽可能地将待测的NMN与胶囊和片剂样品基质中其他成分分离开，首先对流动相溶液配比进行了优化。用50%甲醇水溶液作为提取液溶解胶囊和片剂样品配制成待测液，分别以95% B、85% B、50% B（V/V）的等度分离方式对NMN胶囊和片剂样品进行色谱分离，通过单标法对峰的归属进行了确证，由此判断检测时最佳的流动相比例。分离谱图如图2所示，其中图2a为NMN片剂样品的分离谱图，图2b为NMN胶囊的样品分离谱图。从图中可以看出，随着流动相中甲醇含量的增大，NMN的出峰时间逐渐后移。对于片剂样品以50%比例等度洗脱时，NMN与基质无法得到有效分离，而使用95% B比例等度洗脱时NMN的出峰时间较晚，影响分析方法的效率，而且也伴随着峰展宽。当使用85% B比例等度洗脱时分离效果最好，NMN的出峰时间较短，峰形也基本满足高斯分布，可以达到基质中杂质峰与被分析物色谱峰分离的效果，降低了杂质峰干扰的可能，从而省去对提取液进行净化处理的步骤，可以将分析方法的总体时间控制在8 min内完成，使得操作简便、耗时较短，提高了分析检测效率。对于基质较为简单的胶囊样品，可以看出同样使用85% B比例等度洗脱，具有最好的分离效果、峰形和分析效率。所以采用85% B比例等度洗脱进行后续实验。
对于可离子化的样品，甲酸具有改善峰形的作用。因此，本文对流动相中甲酸的加入进行优化对比，在85%比例等度洗脱条件下，考察了0.1%甲酸加入前后NMN片剂和NMN胶囊剂样品基质中各被测组分分离效果，结果如图3所示。结果表明，不加甲酸，NMN的峰拖尾现象明显，而且出峰时间明显推迟了8 min。而加入甲酸使各被测组分的峰形得到了良好的改善，并将整个分析时间控制在8 min内，极大地提高了分析效率。这可能是由于甲酸的加入抑制了NMN的解离，降低了其在HILIC色谱填料上的保留，缩短了出峰时间。所以在流动相中加入甲酸进行后续实验。
综上，对于NMN片剂和NMN胶囊基质，采用添加甲酸的方式能够改善NMN峰形，因此以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇溶液（15:85，V/V）为流动相进行分离。
2 提取溶剂优化
根据NMN的理化性质，NMN在水中溶解度较大，在甲醇中溶解度较小，在仪器及实验条件相同情况下，本实验选择了水溶液、50%甲醇水溶液、85%甲醇水溶液3种溶剂开展样品提取溶剂优化实验。由于NMN在甲醇中几乎不溶，故不选择用纯甲醇作为提取溶剂。取0.5 g粉碎后的片剂和胶囊样品，向其中各添加一定量的NMN标准储备液，使加标浓度为10 μg/mL，采用方法中的样品提取方式，分别以上述3种溶剂进行提取，并测定加标回收率，结果如表1所示。从表1中可以看出，以50%甲醇水溶液作为提取溶剂，样品的回收率可控制在90%~110%之间，同时偏差最小，具有最佳的提取效果。因此，在后续实验中采用50%甲醇水提取溶剂进行提取。
3 标准曲线、检出限、定量限
以方法中的色谱分析条件对NMN标准工作溶液进行测定，通过iChrom5100 workstation绘制标准曲线回归方程，其线性范围、相关系数、LOD及LOQ如表2所示。
由表2数据可知，本方法在5~500 μg/mL范围内有较好的线性关系，相关系数r为0.999。经计算，NMN的检出限（LOD，S/N=3）为1.0 mg/kg，定量限（LOQ，S/N=10）为3.0 mg/kg。
4 仪器精密度实验
按照方法中实验步骤，对浓度为90 μg/mL的NMN标准溶液进行6次平行测定，将测得的NMN的响应值带入线性方程计算得到溶液中NMN的含量，并计算6次测定结果的RSD如表3所示。
由表3数据可知，仪器精密度实验结果的RSD为0.3%，表明本文发展的液相色谱方法具有较好的重现性，方法精密度较好，可以用于后续实际样品中NMN含量的测定。
5 稳定性实验
以方法中实验步骤进行操作，考察方法的稳定性，经过6次平行实验，测得片剂和胶囊样品中NMN的浓度与RSD如表4所示。
由表4数据可知，对于NMN片剂和NMN胶囊，6次测定结果RSD均较小，说明结果都保持高度一致，可以保证方法的稳定性。
6 重复性实验
按照方法中的实验步骤，将测得的NMN片剂、胶囊原液的6组平行样品中NMN的浓度及RSD计算汇总，结果如下表所示。
由表5数据可知，两种样品重复性实验的RSD在0.6%~1.8%之间，表明本方法重复性较好，表明本文开发的前处理方法结合HPLC方法可以用于NMN片剂和NMN胶囊中的NMN含量测定，并能使结果具有良好的重复性。
7 加标回收率实验
按方法中步骤进行操作，对制备的5、10、50 mg/kg的低、中、高三种加标水平的NMN片剂和NMN胶囊剂样品中NMN含量进行了测定，并计算回收率和RSD%，结果如表6所示。
由表6数据可知，NMN片剂和NMN胶囊样品中NMN的检测回收率在90.9%~108.9%之间，相对标准偏差均不超过1.9%，表明本方法回收率好，结果准确可靠，本方法可用于实际样品中NMN含量的准确测定。
8 实际样品测定
按照本文发展的NMN片剂和NMN胶囊剂样品基质中NMN含量的检测方法对市售6个品牌的NMN产品中的NMN含量进行分析测试，检测结果见表7。
实际样品分析结果表明，所有样品中都检出了NMN，但是部分产品的实际含量较其标称含量偏少，如2号样品中NMN含量只有其标称值的一半，3号样品中NMN含量只有其标称值的三分之一，涉及虚假宣称。
结论
本文建立了一种NMN胶囊和NMN片剂基质中NMN含量的检测方法，方法通过调节色谱分离条件，使目标组分与基质成分完全分离，无需进行样品净化操作，同时控制流动相组成，整个分析时间控制在8 min内，具有操作简便、检测效率高、准确性好等优点。该方法为制定NMN跨境产品中NMN含量的检测方法标准奠定了方法学基础，对于提高NMN相关产品质量，促进相关产业的便捷监管具有深远意义。
通信作者简介
兰韬，男，博士，2014年毕业于上海交通大学，获得工学博士学位。于2014年至2015年，在美国俄克拉荷马大学进行生物化学博士后研究，回国后于中国标准化研究院进行天然产物分离分析研究工作。主持参与了20余项国家、省部级科研项目。主持制定了辅酶Q10等4余项国家标准样品以及《马铃薯茎叶及其加工制品中茄尼醇的含量测定 高效液相色谱-质谱法》16项国家、行业标准，申报20余项国家发明专利和实用新型专利，其中6项国家发明专利和4项实用新型专利获得授权，在SCI期刊和国内核心期刊发表学术论文20余篇。为Analytical Chemistry等多本知名SCI杂志进行论文评审。
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