【前沿】山东棉花研究中心利用基因编辑技术创制油酸含量高达78%的棉花新种质- 大数跨境

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【前沿】山东棉花研究中心利用基因编辑技术创制油酸含量高达78%的棉花新种质

山东农业科技智库

2020-11-09

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近日，Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“High oleic acid content, nontransgenic allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum L.) generated by knockout of GhFAD2 genes with CRISPR/Cas9 system”的论文，首次报道了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制出非转基因高油酸棉花新种质的研究结果，为改良棉籽油品质和高油酸棉花分子育种奠定了基础。

FAD2基因是油脂合成代谢过程中的关键基因，其编码的Δ12-脂肪酸脱饱和酶催化油酸（C18:1）进一步脱饱和形成亚油酸（C18:2）。陆地棉为异源四倍体，其基因组中含有8个FAD2同源基因，其中GhFAD2-1A/D与拟南芥FAD2基因相似性最高，亲缘关系最近；表达分析发现GhFAD2-1A/D主要在种子中表达，尤其在种子发育中后期，表达量更高，预示其在调控棉花种子油分组成中发挥重要作用。

该研究以棉花GhFAD2-1A/D基因为靶标，分别在其DUF3474和Fatty acid desaturase结构域设计了2个靶点，利用pRGEB32-GhU6.9-NPT II载体构建了GhFAD2-1A/D基因的双靶点编辑载体，通过农杆菌转化棉花品系Jin668，获得了35株独立的T0代再生植株，经PCR检测，发现25株（71.43%）含有编辑载体上的NPTII和Cas9基因。利用Sanger测序检测产生的突变，发现2个靶点均有突变发生。在25株阳性独立植株中，有19株（有效率76%）在目标位点检测到突变。突变类型以单碱基插入缺失为主，同时也检测到了长片段碱基缺失，为2个sgRNA共同作用的结果。利用PCR和Sanger测序检测T1植株，发现所有T0突变均稳定遗传到T1代，同时也在T1代中发现了新的突变。尤其重要的是，在T1代中检测到了4个无载体筛选标记基因的突变单株，被称为非转基因（nontransgenic）突变株。棉花基因组中含有21个GhFAD成员，利用Sanger测序详细分析了19个潜在的脱靶位点，结果未检测到脱靶效应。利用GC-MS分析了4个非转基因突变单株种子的脂肪酸组分，与对照Jin668相比，突变体种子中的油酸含量显著升高，亚油酸含量显著降低。以m20-2为例，油酸含量由13.94%（对照）提高到77.72%，亚油酸含量由58.62%（对照）降低到6.85%，同时棕榈酸含量也显著降低。作者还检测了高油酸突变体的主要农艺性状，发现敲除GhFAD2-1A/D基因并不影响棉花产量、纤维品质、种子总油分含量和种子萌发率。