​大连民族大学李婷婷教授等|鱼骨泥酶解工艺优化及酶解液呈味特性研究

鱼骨排中基本成分含量如表2所示，鱼骨中营养物质含量丰富，具有高蛋白、低脂肪的特点，适用于后续鱼骨泥酶解的研究。

酶解法便于控制且反应条件温和，由于蛋白酶具有专一性和选择性，可以赋予酶解液不同的风味。以水解度为指标，研究不同蛋白酶的酶解效果。使用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶对鱼骨泥进行酶解，实验结果如图1(A)所示，可以看出不同蛋白酶对鱼骨泥水解度的影响差异显著（P<0.05）。在风味蛋白酶作用下，酶解液的水解度最高，为33.83%。有研究表明，风味蛋白酶可以赋予酶解液较好的风味，而且可以将肽链末端的疏水性氨基酸切除，降低苦味，因此选取风味蛋白酶为水解用酶。

不同酶解时间对鱼骨泥水解度的影响如图1(B)所示。由图可知，酶解4 h后，水解度增加不明显，酶解5 h时水解度达到最大值，这可能是因为随着时间的延长，反应体系中的底物基本被完全酶解，酶解过程基本结束，故选取4~6 h为最佳酶解时间段。

不同加酶量对鱼骨泥水解度的影响如图1(C)所示。由图可知，加酶量在0.2%~1.0%范围内，水解度随着酶添加量的增多呈现先上升后下降的趋势，在添加量为0.8%时水解度最大。这是由于蛋白酶添加量增多时，酶与底物的触点增多，酶解效果显著提高，但当酶添加量过多时，酶与底物作用位点被完全占据，即此时的鱼骨泥不能满足更多蛋白酶酶解所需的营养成分，因此继续增加蛋白酶含量水解度没有提升，故选取0.6%~1.0%为最佳蛋白酶添加量范围。

不同料液比对鱼骨泥水解度的影响如图1(D)所示。由图可知，水解度随料液比的增加呈下降趋势，这可能是由于料液比浓度较低时，物料粘稠，增大了酶与底物间的碰撞接触，酶解效率较高，但当料液比低于1:1 g/mL时，物料过于粘稠，影响酶解效率。当料液比浓度增大时，酶与底物不能进行有效接触，水解度下降，同时由于料液比增大，对溶液中的可溶性肽有一定的稀释作用，故水解度下降，因此最佳料液比范围选取1:1~1:3 g/mL。

以酶解时间（A）、加酶量（B）、料液比（C）三个因素为自变量，水解度为响应值，进行Box-Behnken试验设计，采用三因素三水平进行酶解工艺条件优化，Box-Behnken试验结果见表3。

对实验数据进行多元回归拟合，建立水解度（R）对时间（A）、酶添加量（B）、料液比（C）多元二次回归模型：

R=3.1488+0.09A−0.093B−0.075C−0.077AB+0.195AC−0.015BC−0.35A²−0.478B²−0.298C²。方差分析结果如表4所示，回归模型P值为0.0008，达到了极显著水平，失拟项不显著，表明模型对实验拟合良好，可以用该模型来分析和预测酶解鱼骨泥的工艺结果。C、C²的影响极显著（P<0.01），A²对结果的影响显著（P<0.05），三种因素对水解度影响的顺序为：料液比>加酶量>时间。

各因素间的交互作用如图2所示，由图可知，随着酶解时间的延长，水解度呈先上升后下降的趋势，随着料液比的增大，水解度呈现下降趋势。由响应曲面的陡峭程度可以看出，料液比与其它两因素间的交互较好。等高线图的形状可以反映出两因素交互作用的强弱和显著程度。料液比与其余两个因素交互的曲线比较陡，说明在酶解时间不是很充分和加酶量较少时，降低料液比浓度能明显提高水解度。

利用 Design-Expert统计软件求解回归方程得到，以水解度为指标，酶解鱼骨泥的最佳工艺为：时间5 h，加酶量1.0%，料液比1:1，水解度可达43.92%，在上述最优条件下进行验证实验，水解度可达43.8%，接近预测值。证明通过响应面分析获得的最佳条件是有效可靠的。

将鱼骨泥、鱼骨泥酶解液挥发性气体变化进行PCA 分析，其目的是将电子鼻输出的数据降维成两个不存在信息交叉的新指标，使得原本复杂并可能存在相互影响的数据变得简单明了，性质相似的样品在距离上接近。根据图3(A)可以看出，PC1与PC2的贡献率分别为84.50%和8.68%，两者贡献率之和达93.18%，说明主成分包含了样品的主要气味信息。两组样品主成分没有重叠交互的部分，说明两组样品间气味具有一定差异性。主要表现在酶解后的气味向PC1正向移动，而PC1特征值占比较大，说明鱼骨泥经酶解后，气味特征越发复杂，和鱼骨泥气味差异较大。

根据电子鼻雷达图可以看出鱼骨泥酶解前后的挥发性气体传感器响应值的变化。从图3(B)中可以看出R2、R5、R6、R7的响应值变化较为明显，R2对氮氧化合物灵敏、R5对芳香化合物灵敏、R6对甲烷灵敏、R7对无机硫化物灵敏。鱼腥味主要构成物质是三甲胺，其反应会生成较多的短链烷烃类化合物，酶解后烷烃类化合物含量有所降低。总体来说，酶解可以产生更多的芳香物质和含硫化合物，同时使鱼骨泥中烷烃类、氨类等具有不愉快气味化合物的含量降低，表明酶解可以改善鱼骨泥的整体风味。

电子舌可以有效的反映各样品间的滋味差异，图4反映出鱼骨泥、酶解鱼骨泥各滋味响应值的强度。从图中可以看出，鱼骨泥酶解前后滋味轮廓具有一定的差异性，酶解液的滋味轮廓较大。主要表现为酸味、苦味和咸味的差异，酶解后苦味响应值降低，说明酶解可以对苦味产生一定的削弱作用。酶解液的酸味响应值高于鱼骨泥，酸味可以对苦味产生一定的掩盖作用。在陶宁萍等的研究中，对鱼皮进行脱苦后，酸味亦有上升趋势。咸味可以赋予水产品良好的风味，鱼骨泥经酶解后咸味具有上升趋势，这可能是因为蛋白质水解后产生了具有咸味或类似咸味作用的肽。TAMURA等在酪蛋白水解物类似物合成过程中偶然发现具有咸味的肽，ALEXANDER等研究发现，鱼精蛋白酶解产物经分离纯化得到的精酰胺二肽具有咸味增强作用。

图5为不同处理方式下鱼骨泥特征风味二维和三维GC-IMS谱图，图中每个数据点代表一种挥发性化合物，数量信息用颜色表示，白色对应于相对较低浓度的挥发物，红色对应较高浓度的挥发物。在1.0~1.5 ms漂移范围内，酶解液的信号响应高于鱼骨泥，可以看出两组样品间具有一定的差异。

为更加直观的对比两组样品挥发性风味物质的差异，将二维图谱中所有的待分析峰整合成指纹图谱，如图6 所示，图中每一行代表一个样品中选取的全部信号峰，图中每一列代表同一挥发性有机物在不同样品中的信号峰，两组样品间的挥发性风物物质在种类和含量上的差异均十分显著（表5）。A区域是鱼骨泥中主要呈味物质，表现为癸醛、（E,Z）-2,6-壬二烯醛、辛醛、苯甲醛、庚醛、E-2-己烯醛、己醛、E-2-戊烯醛、戊醛、2-壬酮、2-戊酮、2-乙基己醇、二甲基硫醚等物质的含量较高；B区域是酶解液中主要呈味物质，表现为2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、壬醛、E-2-辛烯醛、3-辛酮、2-庚酮、环己酮、异己醇、2-丙醇、3-甲基丁酸乙酯、丁酸戊酯等物质的含量较高。

醛类化合物是酶解液和鱼骨泥中主要的挥发性风味物质之一，醛类物质的阈值较低，对气味形成的贡献较大，含有6~9个碳原子的醛、烯醛类物质一般具有清香、果香和脂香味。鱼骨泥中的主要呈味物质是醛类化合物，如庚醛、辛醛具有青草味、鱼腥味和令人不愉快的气味，苯甲醛有杏仁的味道，可能与氨基酸的降解有关，（E,Z）-2,6-壬二烯醛是鱼腥味的特征化合物。酶解液中壬醛含量较高，具有强烈的油脂气味和甜橙气息。醛类物质是水产品主要的风味物质，经过酶解作用，可以减少鱼骨泥中的不良风味。

酮类和醇类物质主要来源于脂肪氧化，部分还可与美拉德反应和硫胺素降解的化学物质反应，对香气形成具有较大贡献。酮类化合物是酶解液中主要呈味物质，其阈值一般高于醛类。鱼骨泥中酮类物质主要有2-壬酮、2-戊酮、甲基庚烯酮等，具有柠檬草香味和柑橘样气息。酶解产生了一些新的酮类物质，如3-辛酮、2-庚酮、二氢香芹酮等，具有水果和药草等香气。醇类阈值较高，对气味影响较小，检测出的种类也相对较少，醇类物质一般具有令人愉悦的气味，2-乙基己醇有甜味和淡淡的花香。不饱和醇类的临界值较饱和醇低，因此对于气味形成贡献较大，1-辛烯-3-醇具有蘑菇和泥土味等香气。醇类物质具有良好的风味，能够掩盖不良气味，因此可以掩盖一定的腥味。

游离氨基酸具有甜味、苦味和鲜味等呈味特性，对食品风味的形成具有重要贡献。根据表6可知，两组样品中共检测出15种游离氨基酸，其中必需氨基酸7种，半必需氨基酸2种，非必需氨基酸6种，酶解后必需氨基酸占比达58.73%，较鱼骨泥中占比高33.53%。鱼骨泥中游离氨基酸总量为18.72 mg/100 g，酶解液中含量为1095.11 mg/100 mL，酶解后游离氨基酸的含量显著高于鱼骨泥，说明酶解液的水解程度较高。

蛋氨酸、组氨酸是苦味氨基酸，蛋氨酸的含量远低于阈值30 mg/100 mL，有研究表明当苦味氨基酸含量低于阈值时，对总体滋味有利，组氨酸仅在酶解液中检出，其呈味阈值为20 mg/100 mL，酶解液中含量为24.20 mg/100 mL，是酶解液中苦味的主要贡献氨基酸。天冬氨酸、谷氨酸具有鲜甜味，其阈值分别为100 和30 mg/100 mL，酶解液中谷氨酸含量为27.4 mg/100 mL，对于鲜味的贡献高于天冬氨酸。甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸具有甜味，能够赋予食品总体较好的风味，这些具有良好风味的氨基酸在酶解后含量均提升数倍，说明酶解液的风味更佳。陈怡颖等分别研究了鸡肉酶解液和鸡肉中风味成分，分析结果发现鸡肉酶解液中风味成分更丰富，风味更佳。