大连民族大学李婷婷教授等|富集钙乳酸菌的筛选及培养条件对富集效果的影响

图1为七种乳酸菌的生长曲线。由图可以看出，七种乳酸菌的生长趋势大致相同，均呈先上升后平缓的趋势。在对数生长期（4～12 h）生长情况较好的是嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌的生长情况滞后于其余乳酸菌。进入稳定期后各乳酸菌的差异逐渐缩小，此阶段生长情况最好的是植物乳杆菌CY1-1，这可能是由于植物乳杆菌具有广泛性、普遍性，生长稳定，干酪乳杆菌生长情况较其余菌株差。

将七种乳酸菌在钙离子浓度为1.2 mg/mL的氯化钙溶液中进行培养，以溶液中钙离子浓度差与乳酸菌浓度之比显示为钙富集的差异。从图3可以看出，各菌株对钙的富集有明显差异，钙富集量在17.01 到45.41 mg/g间不等，之前亦有实验表明，乳酸菌对金属离子的富集有差异。七种乳酸菌中钙富集量最高的是植物乳杆菌CY1-1，其钙富集量为45.41 mg/g，其次为植物乳杆菌Z7，钙富集量为37.9 mg/g。为探讨乳酸菌复合发酵对钙富集能力的影响，选取以上两种乳酸菌与其余五株菌进行复合，研究复合菌株的钙富集能力。

复合菌株的富集钙能力与产酸量如图4所示。从图3中可以看出植物乳杆菌Z7的钙富集量为37.9 mg/g，经复合后，Z7+DL12组合低于单菌富集量，其余组均高于单一菌种富集量。植物乳杆菌CY1-1钙富集量45.4 mg/g，经复合后，CY1-1+DL10、CY1-1+YP4-5组合低于单一菌种富集量，其余组钙富集量均得到提升。文献表明，乳酸菌复合可能存在竞争抑制，产生负相互作用，使复合菌体浓度下降。而植物乳杆菌CY1-1和嗜酸乳杆菌DL12复合菌株，植物乳杆菌Z7和清酒乳杆菌YP4-5复合菌株，在钙富集量和乳酸含量上均有提升。因此，接下来的试验，选择植物乳杆菌CY1-1、植物乳杆菌Z7、植物乳杆菌CY1-1和嗜酸乳杆菌DL12复合、植物乳杆菌Z7和清酒乳杆菌YP4-5复合菌株作为试验菌株进行钙富集条件的优化。

为了研究时间对乳酸菌富集钙的影响，将四组实验菌株（CY1-1、CY1-1+DL12、Z7、Z7+P4-5）接种于含Ca2+含量为 1.2 mg/mL的MRS培养基中，37 ℃恒温培养24 h，每隔2 h进行取样测定生长曲线。根据生长曲线（图5），各组乳酸菌在4～10 h生长迅速，在14～24 h生长趋势基本平缓，故选取8和22 h为时间点进行实验，研究对数期、稳定期的菌株富集钙的差异。将乳酸菌培养8和22 h，收集并洗涤菌体，将菌体重悬于氯化钙溶液中进行钙富集实验，测定结果如图6所示，可以看出对数期的菌株富集钙含量要低于稳定期。对数期钙富集量约占稳定期的80%～90%，这可能是在细胞增殖过程中，钙与细胞器结合，蛋白质和多糖等物质含有的氨基、羧基、羟基等基团，能与金属离子发生相互作用，而在稳定期乳酸菌生长稳定、生物累积量较大，钙离子通过载体进入细胞或与特定物质结合，从而完成钙的富集作用，因此钙富集量要高于对数期。

将四组乳酸菌分别接种在钙离子浓度为0、0.6、1.2、1.8 mg/mL的培养基中，对四种乳酸菌的生长曲线进行测定。从图7可以看出，各菌株随着钙离子浓度的升高，乳酸菌的生长能力均有所降低。这可能是由于培养基中成分比较复杂，含有K⁺、Na⁺、Mg²⁺等金属离子，而高浓度钙离子的存在，阻碍乳酸菌与其他金属阳离子结合，导致生长能力下降。另外高浓度的金属离子可能对菌体产生毒害或抑制作用，从而使生长量降低。根据图8可知，随着钙离子浓度的升高，钙富集量有所提升。这是因为在氯化钙溶液中进行富集，溶液中仅有一种金属阳离子——钙离子，不存在其他金属离子竞争，菌体的基团结合位点基本上都被钙离子占据，所以富集量较高。植物乳杆菌CY1-1+嗜酸乳杆菌DL12组富集量在钙离子含量为1.8 mg/mL时低于1.2 mg/mL组，这可能是由于钙离子浓度过高，抑制了该复合菌株的离子富集，导致富集量降低。根据钙转化率来看，只有植物乳杆菌Z7+清酒乳杆菌YP4-5组合的转化率和钙离子浓度成正比，这可能是菌株复合后吸附钙离子能力提高，没有因为浓度增大而出现富集量的降低，且该组的钙富集量远高于其余组合，故转化率有所提升。其余三组钙转化率最高的均为钙离子含量为1.2 mg/mL组。结合乳酸菌生长趋势、钙富集量、钙转化率得出，适合乳酸菌富集的钙离子浓度为1.2 mg/mL。

pH是影响生物吸附金属离子的重要因素之一，在较低的pH下，由于氢离子竞争结合位点，导致乳酸菌与其他离子的结合数量下降。随着pH的升高，细胞表面官能团的负电荷增加，从而有利于离子与乳酸菌的结合。如图9所示，Z7和CY1-1+DL12组中，pH在3～5范围内的趋势是pH越小，钙富集量越多，这可能是由于酸性条件下有利于钙离子的溶出，使钙离子更多的暴露在溶液中与乳酸菌进行富集。从四组菌株整体看，最优富集量出现在pH为5、6和初始的pH（7.2），这是因为植物乳杆菌的最适pH在6.2～6.6的范围内。从图中可以看出，Z7的最适pH为6，CY1-1+DL12组的最适pH为7.2，Z7+YP4-5和CY1-1组在pH为5和7.2相差不多。

乳酸菌最适发酵产酸温度是40～42 ℃，而最适生长温度是35～37 ℃。实验选择35、37、40、42 ℃培养实验菌株，在钙离子含量为1.2 mg/mL中的氯化钙溶液中进行富集，比较富集钙效果。从图10可以看出，温度对于各组间钙富集量的影响具有一定差异，四组乳酸菌总体趋势为随着温度升高钙富集量呈先上升后下降趋势。其中Z7+YP4-5组的最适温度为37 ℃，其余三组的最适温度为40 ℃。Mrvčic等研究温度对于乳酸菌富集锌的影响，结果显示乳酸菌富集锌的能力随着温度的升高而提高，原因可能是温度影响了菌体的活性或乳酸菌与金属结合物的稳定性。

原子力显微镜（AFM）可以在接近生理条件的溶剂体系中直接观测生物分子的表面特征，可用于表征不同软度的生物样品甚至活体细胞，并且具有样品处理简单、图像重复性强、力学灵敏度高和空间分辨率高的优势，是研究生物学的有力工具。以植物乳杆菌CY1-1为观察对象，观察乳酸菌富集钙前后菌体细胞变化。图11显示的是植物乳杆菌富集钙前后原子力显微镜微观结构的影响，在三维形貌图中，较暗的区域为表面较低的部分，较亮的区域为表面较高的部分，可以看出，乳酸菌富集钙后的颜色差异较大，细胞表面高度差较大；正常乳酸菌表面凸起形状平坦圆滑，富集后的凸起形状尖锐，说明乳酸菌在与钙结合后聚集颗粒大且多。综上所述，乳酸菌富集钙离子后，菌体表面聚集了大量钙离子，致使细胞形态与正常菌株差异较大。