文章鉴读|中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所徐贞贞研究员：基于不同提取溶剂和色谱分离模式的芒果浆代谢组学研究

食品工业科技编辑部

2025-06-18

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摘要

本研究基于UHPLC-QTOF-MS代谢组学技术，开展了4种提取溶剂和2种色谱模式对芒果浆代谢组学分析的比较研究，旨在通过优化提取溶剂和色谱模式，提出一种优化的代谢组学分析策略。采用四种提取溶剂（纯水、0.1%乙酸水、50%甲醇水、0.1%乙酸50%甲醇水，分别记为H2O、H2O+A、Me和Me+A组）及两种色谱模式（HILIC与RPLC）进行比较，结果表明：提取溶剂中添加0.1%乙酸可提高样品中MS1和MS2的采集数量及峰面积，特别在峰面积为107以上的高响应区间，且样品的可注释组分数量提高，H2O+A组为H2O组的1.39倍，Me+A组为Me组的1.15倍，同时，添加乙酸组的MS2谱图更加清晰，噪音干扰少；（H2O+A）+HILIC和（Me+A）+RPLC模式表现出较强的互补性，与传统仅使用（Me+A）+RPLC相比，联用策略在芒果浆中共注释311种组分，覆盖率增加了近1倍、极性范围扩大了2.4倍。本研究提出的（H2O+A）+HILIC和（Me+A）+RPLC联用分析策略，显著提高了样品中组分的覆盖率和注释率，为芒果浆等果蔬制品中组分解析提供了更加全面的分析方法。

近年来，代谢组学技术的迅速发展为食品及植物样品中小分子组分的分析提供了强有力的工具，不同提取溶剂和色谱模式的选择会显著影响代谢物的覆盖率和注释率。在植物源食品代谢组学分析的样品制备中，常见的提取溶剂包括水和50%甲醇溶液（添加或不添加乙酸），能够有效地提取不同极性的代谢物。Doppler等的研究结果显示，与纯水溶剂和50%的乙腈水溶剂相比，50%甲醇水溶剂可以从大麦中提取到更多的极性和中极性组分，和50%甲醇相比，水溶剂更利于极性组分的提取。本课题组前期研究也证实，与纯甲醇相比，50%甲醇水溶剂能够有效提高针叶樱桃粉组分的覆盖率。此外，有文献报道，向植物的提取溶剂中添加微量乙酸（0.1%~1%）可以提高检测组分的峰强和覆盖范围，进一步提高分析的灵敏度和准确性。反相液相色谱（Reversed Phase Liquid Chromatography，RPLC）和亲水作用色谱（Hydrophilic Interaction Liquid Interaction Chromatography，HILIC）是代谢组学分析中常用的色谱分离模式。前者主要通过疏水作用分离中低极性组分，后者则主要通过氢键、范德华力和离子相互作用分离极性组分。HILIC与RPLC在分离选择性上存在显著差异，二者相互补充，能够显著拓宽代谢物的覆盖范围，从而提高组学分析的全面性和准确性。尽管代谢组学技术在果蔬及其制品中的应用日益增多，但关于不同提取溶剂和色谱模式组合对代谢组学分析影响的系统性比较研究相对较少。

热带水果在全球食品市场中占据重要地位，芒果（Mangifera indica L.）因其丰富的营养价值和独特风味，被誉为“热带水果之王”，占据全球热带水果市场的50%以上。芒果浆作为芒果的重要加工产品，富含酚类、氨基酸、脂质等多种植物化学成分，这些成分不仅为芒果浆带来独特的风味，还具有抗氧化、抗炎等生物活性，赋予了其潜在的健康价值[20]。近年来，随着新茶饮等新消费形态的兴起，芒果浆作为高端果品基料，受到了市场的广泛关注。但现有研究对芒果浆的代谢组学分析仍不全面，尚需进一步系统性的方法研究来提升其成分解析的深度和广度，以推动其潜在健康价值的发掘。针对上述不足，本研究以芒果浆为研究对象，系统比较了四种提取溶剂（纯水、0.1%乙酸水、50%甲醇水、0.1%乙酸50%甲醇水）及两种色谱模式（HILIC和RPLC）在代谢组学分析中的表现。通过分析不同溶剂和色谱模式对代谢物的覆盖率、极性分布及注释效率的影响，本研究旨在提出一种优化的代谢组学分析策略。

结果与分析

2.1 一级质谱信息与覆盖率

总离子流色谱图（Total Ion Chromatogram，TIC）如图1a所示，每个数据点都代表一个MS1峰，通过QC样本进行数据质量控制，验证了数据的可靠性和重复性。根据峰面积的大小，将MS1分为5个区间（103、104、105、106和107以上（图中简写为107−）），并通过堆叠柱状图（图1b）展示QC样品的MS1在不同提取溶剂和色谱模式下的分布情况。结果表明，HILIC和RPLC四组样品中，峰面积大于104的MS1占比均超过98%，大部分集中在104至于105区间。相比于H2O组和Me组，H2O+A组和Me+A组在10³区间内的MS1数量更少，而峰面积大于106的MS1数量在H2O+A组中提高了38.09%，在Me+A组中提高了40.30%。此外，在107以上的区间内，H2O+A组和Me+A组的MS1数量分别是H2O组和Me组的5倍和3倍。

图 1 不同提取溶剂和色谱柱分析的MS1信息

Figure 1. Number of MS1 obtained by different extraction solvents and chromatography modes

注：a：不同提取溶剂和色谱柱分析的MS1信息气泡图；b：不同提取溶剂和色谱柱分析的MS1信息堆叠柱状图；c：不同提取溶剂和色谱柱分析的MS1信息Upset图。

采用Upset图（图1c）分析芒果浆中共有和特有的组分。在HILIC模式下，H2O+A组与H2O组共有的MS1数量为7542个，分别占各自总MS1数量的93.68%和85.31%；H2O组和H2O+A组特有的MS1数量分别为509个和1299个。在RPLC模式下，Me组和Me+A组共有的MS1数量为3355个，分别占各自总MS1数量的89.95%和81.51%；375个MS1仅出现在Me组，761个MS1仅出现在Me+A组。研究结果表明，提取溶剂中添加0.1%乙酸有助于增加MS1的采集数量，尤其是在104以上的区间内，而在103区间内则表现出一定的抑制作用。

上述研究和与前人研究一致，De等的研究结果显示，与75%甲醇相比，0.1%甲酸+75%甲醇在拟南芥中能够提取到更多的MS1数量；Zhang等的研究表明，和0.1%甲酸相比，在提取溶剂中添加0.1%的乙酸后采集的MS1数量提升3倍、峰面积明显提升。在正离子模式下，乙酸可以促进质子化使得在高响应区间内的代谢物更容易被离子化，从而提高MS1的采集数量和强度。而低响应区间的某些组分，可能由于质子化程度的增强，导致竞争性抑制，影响它们的有效离子化，进而导致MS1信号减弱。

2.2 二级质谱信息与注释率

如图2a所示，在不同提取溶剂和色谱模式下，具有MS2的MS1数量占整体的70%以上，且99%的MS2对应的MS1峰面积高于104；在107以上的高响应区间内H2O+A组的MS2数量比H2O组多143，Me+A组比Me组多42；而在103的低响应区间内，仅H2O组和Me组采集到部分MS2信息。如图2b、图2c所示，H2O+A组注释组分数量是H2O组的1.39倍，两组共有组分137个，Me+A组注释组分数量是Me组的1.15倍，两组共有组分117个。图2d显示芒果浆注释组分的峰面积范围大多集中在105到106内，在103的低响应区间内未注释到组分，表明该区间内的MS2可能来源于背景噪声或其他干扰信号；添加乙酸组在低响应区间采集到的信号较少。结果表明提取溶剂中添加0.1%乙酸有助于提高离子化效率，提高代谢物响应强度，高响应区间的MS2采集数量和可注释组分数量更多。此外，添加乙酸可以促进酚类取代基的释放，有助于酚类化合物的提取，H2O+A组比H2O组多检测到12种酚类，包括7-O-甲基芒果苷，甘草黄酮B和芥子醛葡萄糖苷等。前人研究也表明添加乙酸可提高酚类化合物的检出，如Azman等发现pH为1.5的乙酸缓冲液提取的黑醋栗皮中检测到更多的酚类化合物；Herrera-Pool等的研究也表明，与水溶剂相比，1%乙酸水溶剂作为提取溶剂提高了辣椒叶中酚类化合物的响应，木犀草素和芹菜素等酚类仅在1%乙酸水提物中检测到，而未在水提物中检测到。

图 2 不同提取溶剂和色谱柱分析的MS2和注释组分信息

Figure 2. Number of MS2 and annotated compounds obtained by different extraction solvents and chromatography modes

注：a：不同区间内MS1和MS2数量柱状图；b：HILIC色谱定性结果韦恩图；c：RPLC色谱定性结果韦恩图；d：各类注释组分数量。

2.3 注释组分的极性比较

芒果浆注释组分的RT及其在相应流动相中的位置如图3a和图3b所示，疏水常数LogP表示物质在水油两相中的分配系数，LogP越小越亲水，极性越强。HILIC色谱模式中，LogP和RT呈负相关性，组分主要以5%~35%的水相比例中流出，其中低极性组分（LogP>4）在RT为1~7 min段洗脱，而极性组分（LogP<−4）在RT为8~16 min段洗脱，此时流动相中的水相浓度较高，有机相浓度较低，亲水相互作用使得极性组分流出。Wang等[14]研究结果也表明在该洗脱梯度更易于强极性组分的洗脱。RPLC色谱模式中组分的保留主要受疏水相互作用影响，LogP和RT呈正相关性，组分主要在5%~30%的乙腈比例下流出，其中低极性组分（LogP>4）在RT为10~13 min处洗脱，极性组分（LogP<−2）主要在RT为0~3 min的低有机相比例下快速洗脱。此外，RPLC色谱模式中高响应区间注释组分主要在5%~20%的乙腈比例下流出，且响应在107以上的注释组分仅在Me+A组检出。如图3c和图3d所示，不同提取溶剂在HILIC和RPLC色谱模式中的疏水常数LogP范围不同。H2O组中LogP范围为−9.1~13.6，H2O+A组的LogP范围扩大为−9.1~22.4；与H2O组相比，H2O+A组多注释到了3种中低极性的氨基酸、肽类化合物和12种酚类化合物，极性脂质β-甘油磷酸和低极性脂质油酰二棕榈酸酯、三油酸甘油酯（图2d）；Me组和Me+A组注释组分的LogP范围差异较小，分别为−4.5~8.2和−4.8~8.54。结果表明，提取溶剂对注释组分的极性分布有一定影响，添加0.1%乙酸后HILIC色谱的极性分布更为广泛，且极性组分的注释数量增加。

图 3 不同提取溶剂和色谱柱分析所得注释组分的洗脱梯度和极性分布

Figure 3. Elution gradient and polarity distribution of annotated compounds obtained by different extraction solvents and chromatography modes

注：a：HILIC注释组分的保留时间（RT）和相应的流动相；b：RPLC注释组分的保留时间（RT）和相应的流动相；c：HILIC色谱模式下H2O+A和H2O组注释组分的极性范围；d：RPLC色谱模式下Me+A和Me组注释组分的极性范围；当有多个组分极性一致时，根据数量多少依次变大。

2.4 注释组分的谱图比较

HILIC色谱模式中，分别选择H2O和H2O+A组芒果浆共有和特有注释组分进行谱图比较研究。以共有组分7-O-甲基芒果苷为例，其镜像图和峰面积如图4a所示。与H2O组相比，H2O+A组的注释组分镜像图更为干净，噪音干扰少，同时峰面积从4.7×105提高到1.8×106。图4b为H2O+A组特有组分N-甲基-L-脯氨酸在H2O+A组和H2O组中的镜像图，其特征峰为130.08，在两组中均检测到对应的MS2，但在H2O组中77.03和103.05的杂峰和特征峰高度相当，干扰组分的注释，定性得分仅为40，而在H2O+A组中，峰面积从3.8×105增加到1.5×106，且谱图没有噪音干扰，定性得分78，因此N-甲基-L-脯氨酸在H2O+A组中被成功注释。此外，提取溶剂对不同极性组分的检测也有显著影响，乙酸的添加能够促进极性组分的检测，但部分中低极性组分可能会受到离子抑制。如图4c所示，东莨菪苷（LogP为−1.1）仅在H2O+A组中注释出，而β-萘基黄酮（LogP为4.4）仅在H2O组中检测到MS2。

图 4 HILIC色谱模式下不同提取溶剂中注释组分镜像图

Figure 4. Mirror plots of annotated compounds obtained by different extraction solvents and HILIC chromatography mode

注：a：H2O+A（左）和H2O（右）组共有组分7-O-甲基芒果苷的镜像图和峰面积对比；b：H2O+A组特有组分N-甲基-L-脯氨酸在H2O+A（左）和H2O（右）组的镜像图；c：仅在H2O+A组（左，东莨菪苷）/H2O组（右，β-萘基黄酮）注释到的特有组分；**表示T检验P<0.01，表明结果具有统计显著性；图5同。

RPLC色谱模式中，分别选择Me和Me+A组芒果浆共有和特有注释组分进行谱图比较研究。以共有组分阿魏酸为例，其镜像图和峰面积如图5a所示。与Me组相比，Me+A组的注释组分镜像图更为干净，噪音干扰少，同时小提琴图显示其峰面积也更高。图5b为Me+A组特有组分岩豆素在Me+A组和Me组中的镜像图，其特征峰为367.08，在两组中均检测到对应的MS2，但在Me组由于MS2噪音干扰较多，部分杂峰与特征峰的高度相当，干扰组分的注释，定性得分为50。尽管Me+A组中也存在噪音干扰，但由于噪音高度相对较低，能够明显区分特征峰，定性得分为87，表明岩豆素在Me+A组中被成功注释。同样，RPLC色谱模式中，提取溶剂对不同极性组分的检测也有不同影响。如图5c所示，中低极性组分2-乙酰基毛蕊花糖苷（LogP为3.04）仅在Me+A组中得到注释，而在Me组中未检测到相应的MS2信号。相反，N,N-二甲基甘氨酸（LogP为−2.9）仅在Me组中得到注释，在Me+A组中未检测到对应的MS2。

图 5 RPLC色谱模式下不同提取溶剂中注释组分镜像图

Figure 5. Mirror plots of annotated compounds obtained by different extraction solvents and RPLC chromatography mode

注：a：Me+A组（左）和Me组（右）共有组分阿魏酸的镜像图和峰面积对比；b：Me+A组特有组分岩豆素在Me+A组（左）和Me组（右）的镜像图；c：仅在Me+A组（左，2-乙酰基毛蕊花糖苷）/Me组（右，N,N-二甲基甘氨酸）注释到的特有组分。

综上所述，与H2O组和Me组相比，H2O+A组和Me+A组可以采集到更多、响应更高的MS1以及更加干净的MS2，得到的定性代谢物的覆盖率和极性范围更广。因此采用（H2O+A）+HILIC与（Me+A）+RPLC作为最佳方案进行后续研究。

2.5 芒果浆的组分鉴定

如图6a和图6b所示，将（H2O+A）+HILIC和（Me+A）+RPLC两种模式芒果浆的注释结果进行比对，和传统只使用（Me+A）+RPLC模式相比，联用分析策略所得可注释组分数量为传统方法的1.9倍。两种策略联用分析后，在芒果浆样品中注释共到311种组分，包括61种氨基酸、肽及其衍生物、58种酚类、31种生物碱类、26种碳水化合物、24种羧酸、17种萜类化合物、10种脂质、10种维生素和74种其他类别化合物。其中酚类和氨基酸/肽类化合物注释数量提升1.8倍，脂质注释数量提升3.5倍。如图6c所示，和RPLC色谱相比HILIC色谱可注释组分的极性范围分布更广，联用分析策略后可注释组分的LogP值范围为−9.1~22.4，是（Me+A）+RPLC模式的2.4倍。图6d进一步展示了HILIC和RPLC色谱模式中各类组分的LogP值分布，RPLC色谱模式主要分离中低极性组分如C17-鞘氨醇、四羟基-6,8-二异戊二烯基异黄酮、胆汁酸以及二芳基庚烷类芳香族天然产物。HILIC色谱模式主要分离极性组分，如二磷酸胆碱、三甲基赖氨酸、葫芦巴碱、甜菜碱等极性生物碱和极性脂质。此外，还发现部分低极性的磷脂在HILIC色谱模式中被检测到，这可能是由于这些磷脂含有磷酸基、糖基或其他极性基团，使其能够在水溶剂中溶解并在HILIC色谱模式中实现有效检测[31]。本研究表明HILIC和RPLC色谱分离的化合物互补，联用分析策略能够显著提高检测样品中的可注释组分数量和极性范围。

图 6 HILIC和RPLC色谱分析注释组分信息

Figure 6. Annotated compounds obtained by HILIC and RPLC chromatography analysis

注：a：各类注释组分的数量；b：韦恩图；c：注释组分极性范围；d：各类组分极性分布；当有多个组分极性一致时，标志物根据数量多少依次变大。

结论与展望

本研究采用基于UHPLC-QTOF-MS的代谢组学技术，以芒果浆为研究对象，系统比较了不同提取溶剂和色谱模式对代谢组学分析的影响。研究结果表明，向提取溶剂中添加0.1%乙酸能够提高离子化效率，可以增强代谢物的响应强度，高响应区间内MS1和MS2数量显著增加。相比于H2O组和Me组，H2O+A组和Me+A组的谱图噪音干扰较少，可注释组分数量增加、覆盖极性范围更广。不同色谱模式下代谢组学分析结果也有显著差异，和RPLC色谱模式相比，HILIC色谱模式中定性得到的代谢物覆盖率和极性范围更广，二者具有较强的互补性。采用联用策略后，可注释组分数量较传统的（Me+A）+RPLC模式提升了1.9倍，极性范围扩大了2.4倍，显著提高了代谢物的覆盖率和多样性，联用策略在芒果浆中共检测到311种可注释组分。本研究提出了一种基于（H2O+A）+HILIC和（Me+A）+RPLC的联用分析策略，该策略有效拓宽了芒果浆样品中小分子组分的检测范围，为高端果品基料的品质挖掘提供基础数据，并为其他果蔬及其制品的代谢组学分析提供参考方法。

引用本文：张楠，王雪，王珂雯，等. 基于不同提取溶剂和色谱分离模式的芒果浆代谢组学研究[J]. 食品工业科技，2025，46（12）：10−19. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024080198.

Citation: ZHANG Nan, WANG Xue, WANG Kewen, et al. Comparative Study of Different Extraction Solvents and Liquid Chromatography Separation Modes on Metabolomics Analysis of Mango Pulp[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(12): 10−19. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024080198.

基金项目：“十四五”国家重点研发计划项目课题（2022YFD2100805）。

通信作者简介

徐贞贞，女，中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所研究员、博士生导师，中国农业大学兼职教授、博士生导师，中国农业科学院农科英才领军人才（B类）。主要从事果蔬加工及品质形成机制与标准研究。兼任全国标准样品技术委员会（SAC/TC118）委员，中国食品科学技术学会果蔬加工技术分会秘书长、食品安全与标准技术分会委员、青委会工作委员会委员，农业农村部农产品加工标准化技术委员会委员，SCI期刊J FOOD PROCESS PRES和中文核心期刊《食品工业科技》编委、中科院一区SCI期刊J INTEGR AGR（农业科学学报）青年编委。

近五年先后主持“十四五”国家重点研发计划课题（1项）、国家自然科学基金（2项）等国家省部级项目10余项。以第一/通讯作者发表学术论文50篇，其中SCI/EI收录论文34篇；第一发明人获得中国发明授权专利10件；制定国家和行业标准15项，其中国家标准3项。获2020年教育部高校科研优秀成果技术发明奖一等奖（排名第二）、2019年中国发明专利优秀奖（排名第三）等省部与行业奖励共 4 项。

（以上信息来自中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所官网）

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