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本文获2024 年度“十四五”国家重点研发计划项目（2024YFF1106202）；河南省科技攻关（242102110092）；国家重点研发科技项目（2022YFF1101600）；河南省重大科技攻关项目（221100110500）；河南科技大学校特聘教授科研经费（13510004）；中原领军人才项目（234200510020）。。
摘要
为加强芦丁和溶菌酶在食品工业中的应用，制备了芦丁-溶菌酶复合物，并通过喷雾干燥法制备了芦丁-溶菌酶复合物微胶囊。本文首先通过分子对接和分子动力学探究了芦丁和溶菌酶之间的相互作用，然后研究了芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的最佳制备工艺，最后对该微胶囊进行了表征。结果表明：芦丁和溶菌酶可以通过氢键等作用形成稳定的复合物；芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的最佳制备工艺为壁材比1:2、芯壁比1:2、均质速率9000 r/min、干燥温度170 ℃；粒径电位结果显示该微胶囊的分散稳定性良好，三维荧光和红外光谱的结果说明芯材与壁材之间发生相互作用，形成了更多的氢键，扫描电镜下该微胶囊的表面完整、无裂隙。体外消化模拟试验的结果表明，芦丁-溶菌酶复合物经模拟胃消化和肠消化后，DPPH自由基清除率分别为21.4%±1.21%和18.64%±0.6%，抑菌率分别为28.02%±2.32%和13.01%±0.61%，而经过包埋后，其DPPH自由基清除率显著提高至41.43%±1.03%和34.09%±0.9%（P<0.05），抑菌率提高至31.04%±1.4%和21.95%±1.22%，说明该微胶囊能够有效保护芦丁-溶菌酶复合物的抗氧化活性和抑菌活性。此外，微胶囊的释放动力学模型表明，4 ℃时其释放机理参数为0.93，介于扩散限制动力学（0.54）与一级反应动力学（1.00）之间，说明其在低温条件下能有效地缓释芦丁-溶菌酶复合物。综上所述，该研究有望为天然活性成分在食品领域的应用提供新的研究思路。
芦丁是一种天然类黄酮多酚，具有多种生理活性。溶菌酶是一种抗菌蛋白，广泛存在于许多自然生物组织中，可以有效水解细菌细胞壁的主要成分肽聚糖，从而导致细菌细胞体的裂解，且溶菌酶对人类细胞没有不良影响。然而，芦丁和溶菌酶在实际应用中存在一定的缺陷。首先，芦丁的可溶性较差，且易与胃蛋白酶结合，在体内的生物利用度较低，大大限制了应用价值。其次，溶菌酶对革兰氏阴性细菌的抑菌作用较弱。因此，迫切需要一些方法来弥补芦丁和溶菌酶在食品保鲜上的不足。多酚-蛋白质相互作用是近年来的一个热门话题。
多酚组分与蛋白质形成的复合物往往结合了这两种物质的优点。蛋白质主要通过非共价相互作用（如氢键）与多酚结合。多酚是很好的氢供体，其分子上的羟基可以与蛋白质分子上的氧、氮原子、羧基和氨基形成氢键。一些研究表明，蛋白质和多酚的结合可以改善蛋白质的功能特性，也能提高多酚的生物利用度。例如，Yuan 等发现芦丁诱导了 β-乳球蛋白的 α-螺旋含量增加，使蛋白质结构更加稳定。陈卉等制备了槲皮素-卵白蛋白复合物，与纯蛋白相比，复合物的抗氧化性增强，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌也表现出更为优异的抑菌效果。
微胶囊化是食品领域的一种常用手段。将生物活性物质包封于多糖、蛋白或其他物质形成的壁材之中，可以提高其生物功效、水溶性和感官特性，保护其生物活性。在食用时，还能保护其不被胃肠道环境消化，对被包埋的物质起到缓释效果，更好地发挥对人体的有益作用。例如，Qi 等制备了具有良好热稳定性和缓释特性的黄原胶/玉米醇溶蛋白-维生素 E 微胶囊，抗氧化性能比未经处理的维生素E 高出 3 倍以上，有效的保护了维生素 E 的生物活性。Li 等以低聚果糖和乳清蛋白为壁材制备了负载花青素的微胶囊，研究结果表明，与游离花青素相比，将花青素微胶囊化极大地提高了其抗氧化能力和消化过程中的稳定性。然而目前为止，对于多酚-蛋白质复合物微胶囊化的研究极为匮乏。
本文首先通过分子模拟技术，验证了芦丁和溶菌酶之间的相互作用，再通过喷雾干燥法制备芦丁-溶菌酶复合物微胶囊，并对芦丁-溶菌酶复合物微胶囊进行表征。最后测定微胶囊的释放曲线，并建立其释放动力学模型。该研究有望扩大天然活性成分在食品工业的应用。
结果与分析
通常情况下，通过喷雾干燥法制备的微胶囊需要考虑壁材比、芯壁比、均质速率和干燥温度对微胶囊包埋率的影响。如图 3（A）所示，随着阿拉伯树胶的比例不断增大，包埋率呈现出先上升后下降的趋势，在 β-环糊精:阿拉伯树胶=1:2 时包埋率最大。呈现这种趋势的原因可能是在 β-环糊精:阿拉伯树胶=1:2 时，两种壁材之间的交联程度最大，交联效果最好，能够形成致密的层状结构 ，被包埋物质不易从壁材的孔隙之中逸出，因此包埋效果最好。
芯壁比对包埋率的影响结果如图 3（B）所示，随着壁材的比例增大，包埋率呈现出先增大后减小的趋势，其原因可能是壁材较少的情况下，壁材与芯材不能充分接触，且壁材形成的微胶囊外壳较薄，容易发生破裂，导致包埋率较低，这与 Garzón 等的研究结果一致。因此，当芯壁比为 1:2 时，微胶囊的包埋率最高。
均质速率对包埋率的影响结果如图 3（C）所示，随着均质速率的增大，包埋率呈现出先增加后减小的趋势，这主要是由于均质速率过低，壁材乳液不能均匀分散，无法充分包埋芯材，而过快的均质速率会破坏已经形成的微胶囊的结构，导致芯材逸出，使得包埋率降低。因此，当均质速率为 9000 r/min 时，微胶囊的包埋率最高。
喷雾干燥温度对包埋率的影响结果如图 3（D）所示，随着干燥温度的增大，包埋率呈现出先增加后减小的趋势，这主要是由于喷雾干燥的原理是通过干燥介质如热空气等与微胶囊乳液进行热交换，使其固化。过低的温度会导致热交换不充分，固化不彻底，而温度过高又可能破坏芯材与壁材之间的交联 ，所以过高或过低的温度都可能导致较低的包埋率。因此，当干燥温度为 170 ℃ 时，微胶囊的包埋率最高。
综上所述，当 β-环糊精:阿拉伯树胶为 1:2、芯壁比为 1:2、均质速率为 9000 r/min、干燥温度为170 ℃ 时，微胶囊的包埋率最高。因此，选择在此条件下制备的微胶囊进行后续的试验。
粒径和电位分析能够直观地反映微胶囊的大小及其乳液的稳定性。如图 4 所示，芦丁-溶菌酶复合物的粒径小于 1000 nm。壁材的粒径在 1000~1500 nm 的范围内，而芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的粒径更大，在 1500~2000 nm 的范围内，说明芦丁-溶菌酶复合物与壁材产生交联，嵌入到了壁材的空腔内，形成直径为微米级的微胶囊。PDI指数通常用于描述聚合物分子量分布，PDI 越小，分子量分布越均匀。图 4 中芦丁-溶菌酶复合物的 PDI为 0.8 左右，而芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的 PDI 小于 0.5，说明芦丁-溶菌酶复合物微胶囊分布更加均匀、稳定。
ζ-电位是表征胶体分散系稳定性的重要指标。由图 4 可知，芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的绝对值最大，说明分子间抵抗聚集作用的能力最强，体系最稳定。芦丁-溶菌酶复合物主要带正电荷，壁材主要带负电荷。两种相反电荷相互吸引产生静电力，是导致芦丁-溶菌酶复合物微胶囊形成的驱动力之一。以上结果表明芦丁-溶菌酶复合物微胶囊具有较低的聚集倾向和良好的均匀性。
图 4 芦丁-溶菌酶复合物、壁材和芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的粒径（A）和 ζ-电位（B）
Fig.4 Particle size (A) and ζ-potential (B) of rutin-lysozyme, wall materials and rutin-lysozyme complex microcapsules
三维荧光光谱法能够反映发光基团和蛋白质结构的微观变化以及微环境的变化，分析芦丁-溶菌酶复合物、壁材和芦丁-溶菌酶复合物微胶囊之间的结构差异，并确认芦丁-溶菌酶复合物是否被壁材包埋。对三维荧光光谱进行去瑞利散射处理以更好地观察特征峰。图 5 从左至右依次为芦丁-溶菌酶复合物、壁材和芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的三维荧光图谱和相应的等高线图，它们均有一个明显的特征峰。该峰的变化由色氨酸和酪氨酸主导。图 5 表明，芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的荧光强度明显低于芦丁-溶菌酶复合物，并且在等高线图中能够发现，最大发射波长和最大激发波长均出现明显的蓝移现象，这说明壁材与芦丁-溶菌酶复合物之间发生相互作用，增大了极性，降低其疏水性。形成微胶囊后，荧光强度明显降低，这可能是由于芦丁-溶菌酶复合物中的多肽链展开，着色基团嵌入微胶囊的疏水区域，这也证明了壁材对芦丁-溶菌酶复合物的包埋良好。这一结果与之前的研究结果相似，Kim 等在利用鸡蛋磷脂酰胆碱包埋肉桂酰明胶和海藻酸肉桂酰时发现，与磷脂酰胆碱和肉桂酰聚合物的三维荧光光谱相比，包埋体系的荧光强度也明显减小。
利用红外光谱可以进一步分析芯材和壁材之间的相互作用。芦丁-溶菌酶复合物、壁材和芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的红外光谱图和二级结构比例如图 6 所示。红外特征峰与特定的官能团有关。其中，位于 3500~3200 cm−1的特征峰主要是由 O-H 的拉伸振动引起的。从图 6 中可以看出，壁材包埋了芦丁-溶菌酶复合物之后，该范围内的峰强度变大、峰形变宽，说明芦丁-溶菌酶复合物与壁材之间发生相互作用，产生了氢键。2928 cm−1处的吸收峰与 C-H 的拉伸振动有关。波长在 1700~1600 cm−1的范围被称为酰胺Ⅰ带，与蛋白质二级结构密切相关，芦丁-溶菌酶复合物被包埋后该峰发生红移且峰强度减小，可能是壁材与芦丁-溶菌酶复合物发生相互作用，导致壁材中部分 C=O 断裂。壁材和芦丁-溶菌酶复合物微胶囊在 1250~1000 cm−1处有一个特殊的吸收峰，这是由于 C-C 的伸缩振动引起的，芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的峰强度更大，说明壁材与芯材之间发生相互作用，影响了壁材的结构。此外，芦丁-溶菌酶复合物在 2300 cm−1左右出现了由 C≡C 伸缩振动引起的吸收峰，壁材和微胶囊在 1100 cm−1左右与芦丁-溶菌酶复合物有显著差异，这与阿拉伯树胶和 β-环糊精的-CO 振动有关。
二级结构相对含量的结果表明，与芦丁-溶菌酶复合物和壁材相比，芦丁-溶菌酶复合物微胶囊中的β-折叠含量较高，β-转角含量较低。与芦丁-溶菌酶复合物相比，芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的 β-折叠含量增加了 8%，而 α-螺旋含量增加了 11%，β-转角减少了 34%。β-折叠和 α-螺旋的增加表明芦丁-溶菌酶复合物与壁材之间形成氢键，微胶囊的结构呈有序趋势，说明芦丁-溶菌酶复合物成功嵌入壁材中。
芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的微观结构如图 7 所示。图 7 中有两种类型的物质，分别是空心壁材和芦丁-溶菌酶复合物微胶囊。壁材多呈扁平状，表面较为光滑，没有褶皱，中间部分有较为明显的凹陷。而微胶囊呈现出球状，表面有明显的凹陷和褶皱，这与裴慧敏等的研究相吻合，原因可能是在喷雾干燥过程中，水分迅速蒸发，壁材迅速固化，冷却后因温差效应导致颗粒表面形成褶皱，发生凹陷。另外，由于芯材分散于壁材之中，且为中空结构，壁材缺少支撑，导致微胶囊出现皱缩。壁材与芦丁-溶菌酶复合物微胶囊微观结构上的差异直观地证实了芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的形成。此外，芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的表面未见明显的裂缝或孔隙，说明壁材的包埋效果良好，能够有效阻止外界环境干扰，保护芦丁-溶菌酶复合物的生物活性。
通过检测芦丁-溶菌酶复合物被包埋前后胃肠道模拟消化物的抗氧化活性和抑菌性，研究了微胶囊对芦丁-溶菌酶复合物消化过程中生物活性的保护作用。如图 8（A）所示，未消化时二者的抗氧化性相差不大。经模拟胃液和肠液消化后，被包埋芦丁-溶菌酶复合物的抗氧化性显著（P<0.05）高于未被包埋的芦丁-溶菌酶复合物。在图 8（B）中，体外消化模拟前，两种样品的抑菌性能相差不大，芦丁-溶菌酶复合物抑菌率略高于微胶囊。经胃液消化后，二者依然没有显著的差异，而在肠液消化后，芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的抑菌率则显著（P<0.05）高于未被包埋的芦丁-溶菌酶复合物。出现这种现象的原因可能是多糖类的壁材具有优良的成膜性能，有助于形成更密集的网络，并加速芯材与壁材料的交联。此外，不同多糖类壁材的组合可能会增加壁材之间的相互作用，形成更刚性的结构，从而构建一道屏障，保护芯材的生物活性。这一结果说明微胶囊化有助于芦丁-溶菌酶复合物在人体中更好地发挥功能，提高生物利用度。
微胶囊的释放曲线是其在应用时的重要依据之一。由图 9（A）可知，芦丁-溶菌酶复合物在微胶囊中的保留率随着时间延长呈现出逐渐下降的趋势。在72 h 内，整个释放过程较为平缓，释放速率均匀。4 ℃贮藏 72 h 后，芦丁-溶菌酶复合物的保留率仍有92.93%，这可能由于壁材良好的隔绝性避免了芦丁-溶菌酶复合物的快速释放。在同一贮藏时间下，随着温度的升高，芦丁-溶菌酶复合物的保留率逐渐降低，这说明温度升高促使微胶囊壁材破损，膜壁空隙增大，芦丁-溶菌酶复合物释放受到的阻力变小，释放速率加快；另外，高温将导致芯材的分子热运动加快，从而加速释放。因此，微胶囊的贮存过程应尽量避免高温，但对冷鲜贮藏的食品仍具有良好的保鲜效果。
Avrami’s 公式对不同温度下芦丁-溶菌酶复合物微胶囊释放动力学的拟合曲线如图 9（B）所示。由表 1 可知，对芦丁-溶菌酶复合物微胶囊在各温度下拟合的回归方程的 R 2 均大于 0.98，说明拟合结果良好，该方程适用于描述芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的释放动力学。释放机理参数 n 表征了微胶囊芯材的释放模式。当 n=1 时，释放过程符合一级动力学，芯材的释放与浓度成正比；当 n>1 时，释放过程涉及成核和生长机制，释放速率随时间增加；当 n<1 时，释放过程可能受到扩散限制。芦丁-溶菌酶复合物在4、25、45 ℃ 下的释放机理参数 n 分别为 0.93、1.07、1.11，其中 4 ℃ 下的芦丁-溶菌酶复合物微胶囊释放反应介于扩散限制动力学（0.54）与一级反应动力学（1.00）之间，说明在低温条件下，微胶囊能有效地缓释芦丁-溶菌酶复合物地释放。而当温度为 25 ℃和 45 ℃ 时，芦丁-溶菌酶复合物微胶囊的释放反应略大于一级反应动力学，说明此时芦丁-溶菌酶复合物的释放会受到单位溶液中微胶囊浓度的影响，浓度越大，释放速率越快。不同温度条件下的释放速率常数 k 分别为 7.51×10−4、2.67×10−3、5.01×10−3 ，可以发现，随着温度升高释放速率常数 k 明显增大，说明低温贮藏（4 ℃）将有效稳定微胶囊的释放。
Citation: YANG Le, LIU Lili, CHENG Weiwei, et al. Characteristics and Release Kinetics of Rutin-Lysozyme Complex Microcapsules[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(24): 78−87. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024120303.
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