撰稿 | 杨辰
就像浩瀚无垠的宇宙中有万千星河，人类大脑中分布着千亿数量的神经元，相互交联，错综复杂。而这些神经元是如何连接与沟通的，也是自神经生物学兴起以来一直亟待解决的问题。因此，高空间分辨率的神经元激活技术将对我们精确研究大脑回路以及相关的疾病治疗至关重要。波士顿大学杨辰教授和她的合作团队设计和开发了一种直径为20微米的锥形光纤光声转换器（TFOE）。该转换器通过其纳米复合材料镀层把纳秒激光转换产生高强度和高精度的局部超声。利用这种光声转换器的高空间分辨率局部超声，他们成功地实现了大鼠体外单个神经元甚至亚神经元刺激。对比传统聚焦超声刺激，TFOE巧妙地利用光进行光声转换，从而突破了声波的衍射极限。由纳秒脉冲激光转换成的亚微秒脉冲声波也赋予其高时间分辨率，首次达到了亚微秒单脉冲神经刺激。同时，TFOE 的高精度使其可以与研究神经细胞离子通道的公认标准检测技术------电生理膜片钳技术有机结合在一起，在双光子成像技术辅助下，成功实现了小鼠体外大脑切片中单神经元刺激与膜电位同步实时检测。而这对传统超声刺激而言是极其困难的。相较于其他传统刺激方式，如电极刺激，TFOE实现了更高空间分辨率的神经元局部定位。此外，无需基因转染的优势也让TFOE相比于光遗传学更容易应用于医学研究。
功能性脑疾病(帕金森病、癫痫、抑郁症等)已成为全球性的重大医学问题和沉重社会负担。高空间分辨率的神经元激活技术将对我们精确研究大脑回路以及相关的疾病治疗至关重要。
神经刺激技术通过利用特别外源能量调节神经元活动，从而调节神经回路和系统功能。电、光、声等技术与神经科学相结合产生了深部脑电刺激、光基因调控、光热，光电化学，声刺激等神经刺激与调控技术。其中，电极刺激迄今已经被应用于临床治疗，但由于电流的扩散使其精度限制在毫米级别。近十多年来新兴发展起来的光遗传学技术，实现了细胞水平的精确调控，但基因转染的要求使其很难应用于灵长类动物以及人体研究中。
超声脑刺激凭借其非侵入式特点，近年来得到了广泛的研究，正在开展一些临床实验， 但其作用机理至今众说纷纭。该机理的探究对于进一步了解大脑回路以及相关的疾病治疗至关重要。声波的衍射极限将超声的空间分辨率限制在了毫米级别，从而成为了阻碍研究超声-神经元作用机理的天花板。同时，由于传统超声极易破坏电生理膜片钳与细胞膜之间的高阻封接，使得用单细胞电生理手段进行机理研究至今仍具挑战性。
光声技术凭借其集合了光学高分辨率和超声穿透深度深的优点在近年受到了极大关注，广泛应用于生物医学成像。光声效应中，材料吸收脉冲光能后，发生瞬时的受热膨胀，进而产生声波。2016年，Adrien E. Desjardins 等提出将碳纳米管与PDMS材料结合涂覆到光纤端面，从而产生高能宽频光声信号用于动脉成像。2018年，程继新团队将基于光纤的光声传感器与增强现实图像技术相结合，用于高精度乳房肿瘤切除手术。2020年，程继新和杨辰团队首次将光纤光声传感器用于神经元刺激，实现了亚毫米精度的小鼠体外神经元刺激和活体大脑刺激。而这一应用，开辟了光声技术在神经调控领域研究的道路，受到了越来越广泛的关注。
为了发展高空间分辨率的新神经刺激技术，同时进一步分析单神经元在声波刺激下的活动从而探究声波与神经元之间的相互作用，波士顿大学杨辰与程继新团队设计和开发了一种直径为20微米的锥形光纤光声转换器（TFOE），该转换器光纤端面的碳纳米管-PDMS 涂覆层可在纳秒激光下以点声源的形式产生一个有效直径为40微米的声场，突破了声波的衍射极限，从而实现高空间分辨率局部定位（图1）。通过钙离子成像技术追踪神经元响应，TFOE成功地实现了大鼠体外单神经元刺激（图2）。
图1 精度为20微米的锥形光纤光声转换器（TFOE）。该转换器具有纳米复合材料镀层，当被纳秒激光激发时可高效的产生高强度的局部超声。
此外，TFOE产生的局部声场也成功实现了神经突的激活，并将动作电位扩散到周围神经网络。更进一步地，实验表明声刺激对于神经元轴突与树突具有特异性。TFOE刺激多极神经元的轴突产生的动作电位可反向扩散至胞体，而刺激树突产生的动作电位只在树突局部扩散。这一特异性将有助于了解神经元之间的信号传输机理。
图3 TFOE 实现大鼠体外神经突刺激继而扩散到周围神经网络。
图4 TFOE声刺激对于神经元树突与轴突具有特异性。
在光声转换中，由纳秒脉冲激光转换成的亚微秒脉冲声波也赋予了TFOE声信号的高时间分辨率，首次达到了亚微秒单脉冲下的神经元刺激（图5），从而使刺激条件更接近于神经元自然状态下活动的时间分辨率。
TFOE 的高精度和高局域性使其可以与电生理膜片钳技术有机结合在一起，成功实现了小鼠体外大脑切片中单神经元刺激与膜电位实时同步检测（图6）。除了捕捉到神经元动作电位，研究也发现声场会引起细胞膜瞬时电位变化与离子流变化，从而验证了超声-神经相互作用机理中的离子通道假说。此外，研究团队在实验中通过荧光标记兴奋性与抑制性神经元，在双光子成像辅助下实现了不同种类神经元选择性刺激。结果表明兴奋性神经元较之抑制性神经元，激发阈值更低。对于往研究中超声对大脑产生的或激发或抑制的争议性论点，这一结果也许能引导我们找到最终的答案。
图6 TFOE与膜片钳技术相结合，选择性激发兴奋性或抑制性神经元并实时检测其膜电位。
本研究工作利用光声转换技术搭建了锥形光纤光声传感器TFOE平台，实现了40微米单神经元刺激的空间分辨率与亚微秒单脉冲刺激的时间分辨率。通过TFOE与膜片钳技术相结合，展示了单神经元刺激下的膜电位实时检测，并揭示了神经元在声刺激下的独特电生理活动。该技术在基础研究中有助于进一步探究超声-大脑相互作用机理，同时凭借其微创、无需基因转染、以及与MRI高度相容的特性， 可为后续灵长类动物实验以及临床医学转化研究提供平台。在现今脑科学研究进入一个前所未有的爆发性发展，百花齐放的时代，象这样的新工具可以帮助我们更深一步认识高级脑功能，解释行为，也给脑疾病的诊断和治疗带来阶段式的进步。
该研究成果以” Non-genetic photoacoustic stimulation of single neurons by a tapered fiber optoacoustic emitter”为题在线发表在Light: Science & Applications。
本文共同第一作者为美国波士顿大学博士生施琳莉与蒋颖，通讯作者为波士顿大学电子与计算机工程系及化学系杨辰教授与生物医学工程系及电子与计算机工程系程继新教授。合作者包括波士顿大学的John A. White教授和Heng-ye Man 教授。
https://doi.org/10.1038/s41377-021-00580-z
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