基于非相干光学模拟微分的光学相衬显微镜

撰稿|由课题组供稿

相衬显微镜可以以非染色和非侵入性的方式观察标本，特别适合于观察生物活细胞和临床检查。近日，暨南大学理工学院朱文国副教授提出了一种基于单轴晶体的非相干光学模拟微分模块，实现了未染色洋葱细胞和生物透明活细胞的相衬显微成像。相关成果以《Optical Phase Contrast Microscopy with Incoherent Vortex Phase》为题，于近日发表在国际顶级期刊《Laser & Photonics Reviews》上。

通过光波快速可靠地检测和识别物体是光学成像、机器学习和人工智能的基本关键。光学相衬成像不仅可以实现幅度图案的边缘增强，还可以将不可见的相位图案转化为强度信息，是物体检测和识别最有效的方法之一，因而在生物成像方面得到了广泛的应用。相比于传统的Zernike 相衬显微法和Nomarski 微分干涉法，最近发展起来的光学模拟空间微分法由于其二维各向同性的边缘增强特性及相对紧凑的光学结构受到人们的重视。但是，目前光学空间微分法尚存在结构复杂、不易制备，与传统光学显微镜不兼容，需要相干光源照明等不足之处。

为了实现非相干光的相衬显微成像，我们研究了空间非相干性导致的相位模糊效应。通过对比相干光（He-Ne激光）与非相干光（LED光源）照射下单轴晶体所产生的单阶涡旋光的传播特性，发现焦点附近LED光斑呈高斯分布状，其光涡旋被清洗掉了。离开焦点一段距离后，光涡旋才得以恢复；而相干光束的光涡旋一直存在，如图1所示。

图1. He-Ne激光和 LED光源照射下，单轴晶体所产生的单阶涡旋光的传播特性对比。（a）实验装置；（b,c）横向光强分布随传播距离的变化特性。

为了避免空间非相干性导致的相位模糊效应对相衬显微产生影响，我们选用科勒照明搭建倒置显微系统。在未放样品情况下，照明光被准直进CCD相机，因而由单轴晶体所产的波矢空间调制效应能够在CCD平面保持，不被模糊掉。我们构建了由薄单轴晶体（厚度1mm）和两偏振片组成的相衬显微（光学微分）模块，见图2（a）。该模块可放置在筒镜与CCD相机间的任意位置上。旋转偏振片、改变晶体倾斜角度选择性地利用单轴晶体的几何相位和透射系数的角度色散，可实现一维、二维和二阶微分成像及明场成像间的自由切换，如图2（b）所示。微分成像的空间分辨率由成像系统决定，与光学微分模块无关。实验上，我们展示了USAF 1951分辨率板最细线条（线宽0.755μm）的微分成像。

图2.（a）包含光学微分模块的光学相衬显微镜；（b）矩形物体的明场、一维、二维和二阶微分成像；（c）分辨率板的二维微分成像；（d）沿图（c）红线的光强分布。

图3给出了明场成像和光学微分成像对于强度目标和相位目标的成像效果对比图。光学微分成像可将未染色洋葱细胞细胞壁相对于背景的对比度从明场成像的~1.2提升至~22，有利于细胞形貌的识别。对于透明活细胞NIH-3T3，明场下几乎看不见。但在光学微分成像模式下，其轮廓清晰可见，并具有较高的对比度。

   图3. 未染色洋葱细胞（a-c）和NIH-3T3活细胞（d-f）明场成像（a,d）和光学微分成像图（b,e）。（c,f）沿图（a,b,d,e）白线的光强分布。

本工作基于单轴晶体实现了非相干光的光学模拟微分，构建了与传统光学显微镜兼容的倒置相衬显微镜，实现了可自由切换的明场、一维、二维和二阶微分成像。得益于非相干照明，我们实现了生物透明活细胞的高对比度成像。本研究为基于非相干光源的光学模拟计算开辟了道路，并促进了多功能、紧凑、低成本和高性能相衬显微技术的发展。

论文信息： M. Zhao, X. Liang, J. Li, M. Xie, H. Zheng, Y. Zhong, J. Yu, J. Zhang, Z. Chen, and W. Zhu*, "Optical Phase Contrast Microscopy with Incoherent Vortex Phase," Laser Photon. Rev. 16, 2200230 (2022).

文章链接：

https://doi.org/10.1002/lpor.202200230