​Advanced Photonics | 亚体素光片显微镜打破大视野和高分辨的矛盾

相关成果以Subvoxel light-sheet microscopy for high-resolution high-throughput volumetric imaging of large biomedical specimens 作为封面发表在Advanced  Photonics 上。

在生命科学的研究中，经常需要在不损伤样品（或尽可能减小损伤）的前提下，实现大视野、高分辨率的三维成像。光片显微镜技术是近十几年来发展起来的一种三维光学显微镜技术，当采集物镜与光片平面垂直时产生光片，其厚度和瑞利范围由照明物镜的NA决定。低NA会导致大视野和低分辨；高NA会导致小视野和高分辨，这种分辨率和视野的矛盾通常是不可调和的。目前常见的解决方法是图像拼接，然而图像拼接需要很高的机械精度，多次成像也限制了成像速度。并且由于不同的成像时间，对于活体样品成像有一定的限制。

最近，华中科技大学费鹏教授课题组首次将三维超分辨技术和光片显微技术结合，无需经过图像拼接即可获得大视野下（100 mm³）的高分辨图像，成像通量高达10⁹体素每分钟。该方法的思想是通过获取具有多帧亚体素位移的低分辨图像，利用极大似然估计重建算法恢复出高分辨的三维图像。 

如图1所示，该方法与传统的轴向扫描不同，采用一种斜轴扫描方式。这种独特的扫描方式可以在x, y, z三个方向上产生位移分量。通过合理设计斜轴角度和扫描步长，可以在三个维度产生亚像素的位移。首先对获得的低分辨图像堆栈P进行分组，得到多组具有亚体像素位移的低分辨三维图像堆栈(P₁,…,P_n)。然后将多组低分辨三维图像堆栈作为输入，利用极大似然估计（MLE）迭代重建恢复出高分辨的图像I_svr。最后将斜轴扫描引起的倾斜进行校正。利用这种亚体素超分辨（SVR）方法可以将三维图像的横向分辨率提升3~4倍，轴向提升2~3倍。这种扫描和算法的独特结合称为亚体素光片显微镜（SLSM）。该方法可以用图型处理器（GPU）进行加速计算，进一步提高运算速度。

图1 SLSM原理示意图

由于SLSM可以在三个维度上提升原始图像的分辨率，因此可以利用一个相对较厚的光片进行照明，获得大视野的图像，通然后过算法实现大视野下的高分辨成像。实验中（如图2所示），研究人员采用0.03NA照明的光片和4倍探测物镜对人支气管上皮细胞（NHBE）进行三维成像，利用SLSM重建获得的图像的分辨率较常规光片显微镜同样视野下拍摄的图像有明显提升。然而研究人员用更薄的光片（0.08NA）照明，20倍的物镜采集时，SLSM的结果甚至比20倍物镜采集的图像更好。而后者的成像视野比SLSM减小了25倍。

进一步地，课题组利用该方法对离体的老鼠心脏、活体的斑马鱼胚胎进行了大视野高分辨的观察。结合多视角技术，对高散射的三维HUVEC-HDF细胞簇、鼠脑实现了各向同性的大视野高分辨成像。

图2 利用SLSM对培养的NHBE细胞进行三维成像

由此可见，SLSM有效地克服了视野和分辨率的矛盾，通过获取低分辨下的大视野图像，利用算法恢复出大视野下的高分辨图像。这种无需拼接的高通量成像方法，可以在生命科学的研究中得到广泛应用。

在过去的二十多年里，光学显微成像技术发展迅猛，不断突破传统极限。而在生命科学的研究中，要求成像系统在不损伤样品（或尽可能减小损伤）的前提下，实现更大视野、更高分辨率、更高速度的三维成像。

传统的宽场荧光显微镜利用同一个物镜聚焦激发光和收集样品的荧光信号。这种聚焦光锥的照明方式会照亮整个样品，引入额外的光漂白和光毒性；同时焦平面以外的信号也会被激发，引起焦外污染，影响图像分辨率和对比度。激光扫描共聚焦采用点扫描的方式，通过在照明端和探测端引入一对共轭针孔，滤除了焦平面以外的杂散光，极大地提高了图像的轴向分辨率，实现了三维成像。但是这种照明方式，还是会照亮焦平面以外的地方，引起光漂白和光毒性。同时点扫描的方式，也会极大地限制成像速度。

光片显微镜技术是近十几年来发展起来的一种三维光学显微镜技术。与上述两种显微成像技术不同，光片显微镜采用照明端和采集探测端垂直的结构。照明的片状光与探测物镜焦平面重合，探测时只有焦平面会被照亮激发，而其它位置不受影响。这种独特的照明方式，具有以下几个优点：1）只有焦平面被激发，极大地降低了光漂白和光毒性；2）避免了焦外污染，提升了图像信噪比和轴向分辨率，可以实现三维成像；3）平面照明方式可以结合高量子效率的面阵CCD或sCMOS，实现快速三维成像。

平面照明显微镜（SPIM）是一种常见的光片显微镜，利用柱面镜将一个维度的光压缩，另一个维度不变，形成片状光。照射物镜时，在焦点处形成光片。采集物镜与光片平面垂直，并聚焦在光片照明的平面。利用这种方法产生的光片，其厚度和瑞利范围由照明物镜的NA决定。根据高斯光束传播特性，在同样的入射光条件下，照明物镜NA越小，瑞利范围越大，能够实现较大范围的均匀照明；但是光片的厚度也越大，导致轴向分辨率较低。而高NA的物镜能够产生较薄的光片，具有很高的轴向分辨率，但瑞利范围成倍减小。这种分辨率和视野的矛盾是不可调和的，通常需要做一定取舍。这种轴向分辨率和成像视野的矛盾限制了其在生物医学研究中的应用。

创刊号全部论文详见：

 http://www.clp.ac.cn/EN/JournalArticles/ap?year=2019&volume=1&issue=1 

本文来源：中国激光