撰稿 | Hua（哈工大 博士生）
近年来，微型显微镜的出现为活体动物脑部研究提供了一种新途径，由于其重量轻、体积小的特点，可以被穿戴在活动的小动物（例如小鼠）头部或其他躯体部位，对其神经或其他身体组织以很轻微的影响（如行动不便、疼痛感等）实现显微成像。因此，微型显微镜对动物活动过程中的神经反应研究具有极高的科学价值。
来源：36kr
然而，目前为止绝大多数的微型显微镜均只能实现二维成像，而缺少对于生物微结构进行三维体成像的能力。而已经开发的体成像微型显微镜例如双光子、光片微型显微镜则需要对成像对象进行扫描，造成了运动伪影，增加了系统复杂度和体积重量，该类显微镜还存在时间分辨率和视场大小之间的矛盾。
因此，研究人员将目光转向单帧体成像领域，这类成像系统利用微透镜阵列将整个待测样品的三维信息编码至二维探测平面，并通过计算成像重构三维信息，具有超快的成像速率，其时间分辨率只受相机帧率限制。
一般情况下，基于单帧三维成像的微型显微系统如光场微型显微镜（MiniLFM）存在微透镜阵列对成像分辨率的劣化，并且其体积和重量较普通宽场微型显微镜亦是更大，不便于小鼠等动物的行为自由，最重要的是，为了对神经成像，往往对成像深度的要求很高，因而需要研发一种能够在大的深度范围内高质量成像的微型显微镜。
近日，美国加利福尼亚大学伯克利分校Kyrollos Yanny等研究人员提出了一种新型的微型单帧体成像显微镜，名为Miniscope3D，其体积高度仅为17mm，重量仅为2.5g（相对应的，宽场微型显微镜高度为23.5mm，重量为3g），并且能够以每秒40个体积单元的成像速率对900 × 700 × 390μm3的视场内大多数深度以2.76μm横向分辨率及15μm纵向分辨率进行高质量成像。
该成果以“Miniscope3D: optimized single-shot miniature 3D fluorescence microscopy”为题发表于Light: Science & Applications。
图1为普通微型显微镜、MiniLFM和Miniscope3D结构比较示意图。在微型显微镜系统中，一般利用渐变折射率透镜代替普通显微镜的物镜，有效减少总体积。该种显微镜具体设计已被UCLA大学研究人员开发为Miniscope开源库共享。而具备单帧体成像功能的MiniLFM便是采用的开源库设计，在结构上与宽场微型显微镜类似，只是在像平面处插入一个微透镜阵列（MLA），在二维探测平面中加入角度信息实现单帧三维成像。
图1 Miniscope, MiniLFM和Miniscope3D结构及Miniscope3D原理
本文作者所提出的新型Miniscope3D显微镜同样基于UCLA开发的Miniscope开源库，并将管镜替换为一个相位掩膜，将其置于渐变折射率透镜的孔径光阑即傅里叶空间处。
这样的设计原因有两点：缩减所需体积，并通过傅里叶域的转换减少计算成本。
该相位掩膜由MLA构成，具有两个特点：
首先，MLA分布不均匀，这使得视场内所有位置的点扩散函数（PSF）均不相同，因此可以获得更大的视场；
其次，相位掩膜具有多焦点的特性，即使用的微透镜焦距不相等，这样的结构使得轴向的任何位置都存在聚焦的微透镜，从而空间分辨率得到维持，因此Miniscope3D能在更大的深度范围内获得较高的分辨率。
图2对于采用均匀单焦点、非均匀单焦点和非均匀多焦点MLA的显微系统在成像质量进行比较，在离焦位置，单焦点透镜呈现模糊的成像结果，相对的，多焦点MLA总是存在数个处于聚焦状态的微透镜，因此仍然可以恢复出质量较高的成像结果。
相对于采用均匀单焦点MLA的MiniLFM，多焦点非均匀相位掩膜的应用使Miniscope3D在10倍的成像深度中将横向和纵向分辨率提升了近两倍。
图2 MLA的均匀性及多焦点对微型显微镜成像结果影响
在图像恢复中，算法主要利用了生物样品荧光信号的稀疏性，结合作者构建的正向传播模型，利用压缩感知恢复样品的三维信息。
此外，可访问性是Miniscope3D设计中的一个重要特征。通过在开源Miniscope平台上构建系统，文中方法可以应用于全球众多实验平台。当前使用二维微型显微镜的450个实验室中，任何一个都可以轻松地升级为Miniscope3D。
总的来说，本文提出了一种新型的微型化显微镜Miniscope3D，利用多焦点相位掩膜有效提升了高分辨率成像深度。紧凑的显微镜设计可有效地应用于自由移动动物的体神经成像，以及在培养箱和芯片实验室设备中对动态样品进行三维运动研究。
文章信息
Yanny, K., Antipa, N., Liberti, W. et al. Miniscope3D: optimized single-shot miniature 3D fluorescence microscopy. Light Sci Appl 9, 171 (2020).
https://doi.org/10.1038/s41377-020-00403-7
文章来源：中科院长春光机所 Light学术出版中心
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