撰稿|课题组供稿
近日，深圳大学物理与光电工程学院张晗教授课题组、邵永红教授课题组在基于激光新应用的生物传感器件取得进展。该生物传感器件由自组装的DNA折纸探针适配在SPR芯片上。并结合CRISPR基因剪刀技术来组成。通过CRISSPR技术的单碱基识别和切割能力，可以在z摩尔级别对目标物进行识别。并通过光谱SPR设备的图像识别结合信号检测，可以对癌症或者病毒细菌等目标物进行高灵敏度、高特异性的识别。该工作在实验上验证了对新冠病毒和肺癌标志物的z摩尔检测。该研究成果发表在国际权威学术期刊《Laser & Photonics Reviews》上，标题为“Ultrasensitive DNA Origami Plasmon Sensor for Accurate Detection in Circulating Tumor DNAs”。深圳大学物理与光电工程学院张晗教授、邵永红教授为本文通讯作者，张晗教授课题组副研究员陈挚、硕士研究生孟长乐为本文共同第一作者。该工作得到了广东省科创委、深圳市科创委、深圳市第三人民医院、深圳大学等的资助。
图1 本研究设计的示意图。
在激光应用领域中，表面等离子SPR技术一直是核酸检测技术的金标准方法，然而提高SPR检测灵敏度和特异性是现在社会中急需解决的问题。幸运的是，DNA折纸自组装技术和CEISPR基因剪刀技术的出现提供了解决灵敏度和特异性的可能性。与荧光PCR扩增法相比，激光应用领域中的光学检测方法具有检测速度快，多通道同时检测等优点，结合生物医学中的DNA折纸技术和CRISPR基因剪刀特异性能力，可以更加显著的提高光学SPR的检测能力。
本文提出并实验验证了一种在表面等离子体共振（SPR）生物传感器框架内无缝融合DNA 折纸和 DNA 剪刀技术的方法。这种战略性的合并标志着与传统的 SPR 方法的背离，预示着在基因检测的准确性和精度方面的革命性变化。这种方法的本质在于将基因编辑技巧与 DNA 折纸技术固有的结构适应性结合起来。DNA 折纸的建筑独创性解决了以前阻碍 SPR 生物传感器的挑战，特别是那些与传统的单链DNA 探针相关的挑战。DNA 剪刀和 DNA 折纸的相互作用将 SPR 生物传感器提高到了新的灵敏度、准确性和实用应用的水平，这些领域尚未被探索。在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，EGFR 基因的 T790M 突变的精确鉴定和 KRAS 基因的 G12C 突变等具体结果强调了该方法的潜在影响。据我们所知，这是第一个通过结合 DNA 剪刀、DNA 折纸和表面等离子体共振传感，同时实现单碱基水平分辨率和 z 摩尔级灵敏度的研究。
本文中图 1 阐明了支持精确检测目标 DNA 序列的总体操作架构。该概念设计协调了四组不同的单链 DNA（ssDNA）分子的精心协调的相互作用，最终形成了结构复杂的 DNA 折纸结构。A.合成阶段：在这个初始阶段，三组 ssDNA 链（1 和2,3 和 4,5 和 6）通过硫酸末端锚定在镀金的传感域。同时，第四组 ssDNA（链 7、8 和 9）配备了一个 polyA 序列，形成了与金纳米颗粒（AuNP）的连接。这种分子集合的合成在受控制的环境温度下和谐地进行。B.基因汇编阶段：利用 DNA折纸探针的固有有序性，这些结构均匀地分布在镀金的传感区域，保持单个AuNPs 和底物之间以及 AuNPs 本身之间的精确距离。随着目标 DNA 的到来，DNA剪刀在DNA折纸组装中的ssDNA组件的分裂，从而释放出封装的AuNPs。C.设备配置：分子货物从表面释放触发表面负载的比例减少，导致 SPR 信号的相应衰减。
本文中自组装DNA探针（图2a），具有自行组装的优点，并且通过nm离心管过滤，可以在芯片表面形成均一的介质层来放大释放信号。DNA折纸的自组装能力通过PAGE电泳得到了证实，最初，在 1 链和 2 链的背景下，包含没有连续碱基配对的单 DNA 链，电泳分析描绘了两个不同的条带，在图 2 的第 1 道（L1）中清晰可见。随后，在链 1到链 4 的合并中，某些链被组装成一个瞬时的构型，表现为一个在 140bp 左右的明显条带。（值得注意的是，在电泳中，使用为线性双链 DNA 校准的标记通常会导致三维 DNA 结构由于其较大的构象而表现出相对较慢的迁移。）这条条带伴随着与其他组装链相对应的额外条带的出现，这在第 2 道（L2）中很明显。移到第 3 道（L3），第 1 条链到第 6 条链的融合形成了更复杂的结构构象，在 750bp左右有一个明显的条带。在第 4 道（L4）中，第 1 到 8 股的高潮沉淀了一个接近最终的结构，由在约 2000bp 的一个突出的条带所代表。重要的是，这条车道显示出最小的额外条带，表明这种特定结构形成的高产率。同时进行的透射电子显微镜（TEM）的观察结果进一步支持了 DNA 折纸技术成功组装的验证，如图 2B所示。经醋酸铀酰阳性染色后，清晰可见 1-8 链形成的三角形，表明 DNA 折纸成功组装。因为额外的链 9 链不仅引入了 Cas12a 蛋白的反式切割位点，而且还加入了一个 polyA 尾巴，为金纳米颗粒提供锚定位点，所以它与 1-8 链形成的 DNA 折纸结构的结合是至关重要的。正如在第 5 道中观察到的，第 1 股的合并到。在L5 的底部观察到，在相同浓度下，单带 1 或 2 链的强度较弱，表明第 9 链也可以作为额外的链与 DNA 折纸结合。在成功地证明了 9 链作为一个附加链的结合，为锚定金纳米颗粒到 DNA 折纸结构提供了聚 a 尾巴后，我们继续评估 AuNP 偶联的 DNA 折纸的形成。在接下来的部分中，这个复合物被用作固定在芯片上的核心探针，需要与制备的金纳米颗粒进行细致的合并。图 2C 描绘了一个三角形的主题，在大小和形状上与图 2B 中显示的 DNA 折纸纸相同。这个三角形结构与 50nm 大尺寸的 AuNP 连接（大小尺寸进行对比，以确保偶联物的成型），形成 AuNP 偶联的 DNA 折纸，作为随后固定在芯片上的探针，证明了 DNA 折纸结构的成功。
图2 DNA折纸探针的验证
本文中将DNA折纸配好的芯片，应用在我们自主研发的SPR设备中（Y. Shao* et al., J. Biomed. Opt. 2016, 21, 127003），通过表面等离子传感的灵敏性和快速性，我们验证了CRISPR基因剪刀的特异性和DNA折纸适配芯片对灵敏度的提升。通过评估不同浓度下正确配对的 crRNA 和 dsDNA 模板之间的反应，测定了 CRISPR/Cas12a 荧光检测方法的检测限（LOD）（图 3a 和3b）。通过拟合校正后的回归曲线，计算出 LOD 为 10pM（图 3c），只有在正确配对的反应中才能观察到强烈的荧光信号（图 3d 和 3e），验证了 crRNA 在靶向具有单碱基突变的特定基因序列时具有高度特异性的反式切割能力。
图3 DNA 剪刀式反式裂解试验
本文提供的新型光电生物传感芯片，以及新型的应用于激光领域的生物手段，明显的增强了传统光学检测的能力，DNA折纸形成的介质层将表面等离子传感中倏逝波的漂移从金膜芯片等效转移到DNA折纸层的顶端，进而形成稳定洁净的超灵敏传感表面。
图4 DNA折纸介质层对芯片表面的增强作用
本文中通过光谱SPR的图像识别和信号分析能力，可以精准的计算出目标物的浓度和识别能力。在图 5a 中，用 Cas12a 激活的两种探针（ssDNA 和 DNA 折纸）的比较显示了不同的特征。尽管两种探针都在芯片上附着了相似数量的 AuNPs（
几乎相同），但 DNA 折纸探针显示出更高的被 Cas12a（
）反式切割的潜力。这一观察结果表明，DNA 折纸探针的反式切割效率提高，强调了其强大的切割能力和提高的传感能力。此外，这些结果与图 4 中显示的结果一致。随后，通过使用有或没有 T790M 突变的 EGFR 基因序列和有或没有 G12C 突变的 KRAS 基因的合成 DNA 模板来评估信号阈值。阈值的计算遵循了国际纯化学和应用化学联盟所概述的指导方针，包括空白测量值（没有目标）的总和和其标准差的三倍。如图 5b 所示，考虑到所设计的引导 RNA 是为野生型 EGFR 基因量身定制的，因此 T790M 突变样本的信号在逻辑上预期是阴性的。因此，该信号评估为 (1.02% + 0.61% ∗ 3) = 2.83%。同样，对于没有 G12C 突变的 KRAS 基因，预期的结果是一个负信号，因为 KRAS 基因的引导 RNA 与包含 G12C 突变的序列特异性对齐。该信号评估为（1.32%+0.69%*3=3.39%）。因此，经过系统的考虑，确定了 3.39%的阈值，这是一项旨在后续确定检测限的严格措施划定阈值，信号浓度关系准备进行评估。在这一阶段，采用了一系列梯度浓度的目标 DNA 序列，跨越范围从 10zM 到 100pM。这种细致的探索包含了不同的浓度谱，而不是之前使用的相对较高的 1nM 浓度。通过综合分析，阐明了检测范围内的信号相关性，最终计算出了检测限，分别为 354.81zM 和 141.25zM。更重要的是，我们获得了 EGFR 和 KRAS 基因浓度的标准曲线，从而可以计算出 EGFR 和 KRAS 基因未知样本的准确浓度。
图5 用设备对DNA 剪刀和折纸-SPR 进行测量
在本文中，还进行了临床样本的实验用来展示我们设计的新型的光电生物传感芯片和应用在激光领域中的生物方法对临床检测的能力。如图 6 所示，我们的发现与通过 qPCR 获得的结果非常一致。重要的是，我们的方法成功地检测到了以前被 PCR 错误鉴定为阴性的样本。这些本包括来自 EGFR 突变的患者 No.4、7 和 9，以及来自 KRAS 突变的患者 No.5、6、7 和 9。这种验证坚定地建立了我们的方法的准确性和可靠性。此外，我们的平台显示出检测微小浓度的环状肿瘤 DNA 的能力，这是传统 PCR 方法往往无法克服的挑战。这也证明了我们的生物应用方法在激光领域也形成了很大的突破。通过生物层次的应用方法，我们可以在激光领域中突破一些桎梏，将激光的优势进行更进一步的提升。
本文展示了一种创新的激光新应用，通过将自组装DNA折纸技术和CRISPR基因剪刀技术应用在传统激光领域的应用-表面等离子传感检测方法。突破性的提高了传统SPR检测的特异性和灵敏度。同时该研究还为肺癌的早期诊断和治疗决策提供了一个全新的工具，能够在无需扩增的情况下直接检测基因突变。研究团队通过检测非小细胞肺癌患者EGFR基因中的T790M突变（肺癌早期筛查的关键因子）和KRAS基因中的G12C突变（靶向药Adagrasib的治疗靶点），验证了该技术的有效性。该技术不仅实现了单碱基分辨率，还展示了在复杂生物样本中检测低丰度核酸目标的能力。这一发现对于推动精准医学的发展具有重要意义，将极大地提高肺癌患者的诊断效率和治疗效果，减轻患者的身体和心理负担，同时优化医疗资源的配置，为肺癌早期诊断提供了新的方向和可能性，为未来的临床诊断和治疗提供了重要的科学依据。
Ultrasensitive DNA Origami Plasmon Sensor for Accurate Detection in Circulating Tumor DNAs
Zhi Chen#, Changle Meng#, Xueliang Wang, Jiajie Chen, Jiefeng Deng, Taojian Fan, Lude Wang, Huiling Lin, Hao Huang, Shuang Li, Shuo Sun, Junle Qu, Dianyuan Fan, Xueji Zhang, Yingxia Liu, Yonghong Shao*, and Han Zhang*
Laser and Photonics Reviews
DOI：10.1002/lpor.202300000
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/lpor.202400035
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