荧光显微成像1,2是一种依赖于外源性荧光试剂的成像技术，通过荧光染色等化学染色方法，可以为弱吸收性（透明）生物样品提供高对比度成像；泽尼克相衬显微术（Zernike phase contrast, ZPC）和微分干涉相衬显微术（Differential interference contrast, DIC）则利用相位分布来产生强度图像衬度，这一类方法将相位差或相位梯度转换为强度对比，从而大大地提高了透明物体在光学显微镜下的可分辨性，如图1所示。而定量相位成像技术（Quantitative phase imaging, QPI)3可以定量地反映待测样品沿轴向的光程差延迟，并且能够量化细胞组织结构的某些重要的物理特性，在生物医学成像及生命科学等领域得到了广泛的应用。
区别于二维定量相位分布，通常更多地采用复折射率（Complex Refractive index），即空间介电常数来表征物体的三维光学属性分布。图2展示了未染色细胞样品的定量相位结果与三维折射率结果对比，利用定量相位成像技术恢复得到的相位结果实际上是待测样品三维折射率分布沿垂直于二维平面上的轴向投影信息（2.5D成像），并非物体内部真实的三维信息分布，且不具有轴向分辨能力。而利用衍射层析显微成像技术所恢复出来的是样品在三维体空间中的不同轴向位置的折射率信息分布（3D成像），具有轴向分辨与层析能力。因此，作为一种新型的三维显微成像工具——衍射层析显微成像技术的发展与应用成为了必然的趋势。
光学衍射层析（Optical diffraction tomography, ODT）将数字全息显微镜（Digital holographic microscope, DHM）与计算层析扫描技术（Computed tomography, CT）相结合，将样品相位信息从干涉条纹图像中解调出来，通过旋转振镜来改变照明方向或旋转位移台来旋转物体等方式来获取待测三维物体在不同角度下的定量相位信息分布；然后结合滤波反投影算法（忽略衍射效应）4或者E. Wolf衍射层析理论（考虑衍射效应）5，就可重建出物体的空间三维折射率分布。近年来，光强衍射层析显微术（Intensity diffraction tomography, IDT）6,7作为一类基于非干涉强度测量原理的三维衍射层析技术逐渐崭露头角，它将“恢复相位技术”与“三维折射率重建方法” 二者有机结合，脱离了对于全息干涉测量的需求，由强度图像直接反演出物体的三维折射率分布。
图3展示了在生物医学诊断中常见的X射线断层扫描与光学衍射层析技术的原理类比，并介绍了基于干涉和非干涉测量方法的衍射层析成像的不同实现方式。其中，最具代表性的技术为光强传输衍射层析显微成像 （Transport of intensity diffraction tomography, TIDT）8与傅里叶叠层衍射层析显微成像（Fourier ptychographic diffraction tomography, FPDT）9,10。总而言之，光强衍射层析本质上是受光强传输方程所启发，将透过三维物体的一系列轴向光强分布与该物体三维折射率分布关联起来，再利用相关传递函数理论即可重构出待测样品的三维折射率分布信息。
自E. Wolf提出傅里叶衍射定理之后，多年以来传统基于干涉方法的光学衍射层析技术的原理就没有发生变化，利用干涉全息图来获取不同照明角度下的相位分布，然后将获得二维傅里叶频谱填充至三维频谱空间中；利用相干合成孔径以及二维相位恢复的思想，就可实现基于相干照明下干涉方法的光学衍射层析成像。但照明光源的相干性被拓展时，由相干光到部分相干甚至是非相干照明，传统干涉成像逐步迈向非干涉成像，其中典型的非干涉相位成像技术有光强传输方程（Transport of intensity equation, TIE）11、差分相衬成像（Differential phase contrast, DPC）12,13和傅里叶叠层成像（Fourier ptychographic microscopy, FPM）14–17等；当入射光发生倾斜时，成像系统的光学传递函数会发生调制，我们更多地是通过其传递函数进行解读，并通过相位反演算法恢复出物体的定量相位分布。
相比于传统干涉测量方法，非干涉定量相位成像摆脱了激光以及干涉装置的束缚，兼容部分相干光源和明场成像光路，对于成像过程的实施更加友好。然而，对于以FPM和DPC这一类通过倾斜照明来调控传递函数的典型代表方法来说，其重构过程中存在着低频缺失的问题；当照明情况不满足匹配照明时（照明数值孔径小于物镜数值孔径），二维传递函数在低频处相互抵消，导致低频处频谱成分缺失。而环形照明孔径可使照明匹配条件满足，低频缺失问题得到缓解，基于此照明情况下的定量相位恢复和三维折射衍射层析重构也可以获取较好的成像结果；本研究团队在之前的工作中提出了一系列基于环形照明孔径的定量相位成像11以及强度衍射层析成像技术7,8充分说明了匹配照明条件对于定量相位成像的重要性。
近来，来自韩国科学技术院（KAIST）的Y. Park教授团队将Kramers-Kronig关系引入到定量相位成像领域18，并基于此来解读非对称照明下的相位恢复问题。Kramers-Kronig关系（简称KK关系）是希尔伯特变换的一个特例，其描述了具有因果性的平方可积函数实部与虚部之间的数学联系，即可以通过强度（实部）测量中推断出相位分量（虚部）。而Titschmarch定理则将函数傅里叶变换域半平面的因果性与其空间域解析性关联了起来。然而，KK关系所依赖的物函数半平面解析特性要求信号在傅里叶域仅占据半平面，这需要照明数值孔径严格匹配于物镜数值孔径。这也就是本文开头所提到的“匹配照明条件”，该条件在高数值孔径的成像系统中（例如使用油浸物镜时）通常难以满足，成为该项技术应用于高分辨衍射层析成像的一大关键阻碍。此外KK关系理论目前仅局限于二维相位成像，由二维相位成像向三维衍射层析的拓展还是简单借助于传统E. Wolf的全息ODT思想，亟待进一步发展与完善。特别值得一提的是，光学传递函数理论最近已被广泛应用在定量相位成像与衍射层析成像中，用于定量分析与优化成像系统对相位物体的成像分辨率与信噪比。而早在2017，本文作者团队就揭示了匹配物镜数值孔径的环形照明对提升光强传输方程相位成像的分辨率与离焦衬度19–21，以及对傅里叶叠层显微成像中的低频相位有效重建的重要意义。基于此，研究团队先后提出了基于环形照明的傅里叶叠层显微成像技术（Annular-illumination based Fourier ptychographic microscopy, AIFPM）22和单帧傅里叶叠层显微成像技术（Single-shot Fourier ptychographic microscopy, SFPM）23：研究人员发现“匹配照明条件”下的相位传递函数刚好是频域中关于原点对称且在原点处相切的两个圆形光瞳（如图4（d）所示），这样两个光瞳之间没有相互重叠、相互抵消的部分，保证了相位传递函数能够覆盖所有低频成分，其核心思想与主要结论与Y. Park教授团队所提出的KK关系不谋而合。
在本研究工作中，南京理工大学的研究团队在前期工作的基础上惊喜地发现KK关系中所要求的解析特性在三维空间中的任意照明角度可以得到满足，从而打破了对于匹配照明条件的严格限制，且将KK关系从二维拓展到三维；此外，将函数因果性和半频域平面解析性等价关系相关联，建立了KK关系下物函数解析特性与光学传递函数的统一化理论框架，通过三维传递函数理论和三维KK关系的相互统一解读了单色相干光照明下光场频谱分布关系；利用三维传递函数理论可以使三维KK关系在任意照明条件下得到完美的满足，利用相干照明下的轴向扫描，揭示了通过三维光强传输衍射层析方法可以有效避免匹配照明条件导致的低频缺失问题。
图4（a-c）展示了倾斜照明光对于二维和三维传递函数的调制作用，并利用合成孔径思想，达到全频谱覆盖的目的。而图4（d）和（e）则展示了在任意照明和匹配照明条件下二维及三维相位传递函数分布，当照明孔径为环形匹配照明时，传递函数中的两个光瞳完全分离，此时KK关系中物函数的半平面解析特性得到满足，从而可以求解出相位信息；在任意照明角度下，二维传递函数的幅值响应在低频相互抵消，导致最终在低频处的频谱成分缺失。而三维传递函数的频谱分布在任意照明角度下三维空间中始终是可分离的，即等价三维KK关系中半空间可解析性条件满足，从而打破了匹配照明条件的严格限制。在二维定量相位成像中，为了保证匹配照明条件的满足，即相位传递函数中两个光瞳在低频处完全相切、不相互抵消，基于已有的环形匹配照明的AIFPM方法严格限制了照明角度的分布，而所提出的TIDT-NSA则打破了这一匹配照明条件限制，即可在任意照明角度下满足KK关系中半空间可解析性条件，从而实现了低频相位信息的准确恢复。
装置示意与算法流程
基于上述研究思路，研究团队构建了TIDT-NSA的显微硬件系统，其装置图、数据获取和重建流程如图5所示。通过将传统明场显微镜的照明光源替换为多个环形LED照明单元，可从不同照明角度照射待测样品，并且采集样品在不同照明角度下的多个强度堆栈图像。先将对数运算之后的各个照明角度下的强度图像堆栈进行三维傅里叶变换，得到在不同照明角度下的频谱覆盖支持域；再结合KK关系与三维传递函数的解析特性，恢复出半空间滤波后所对应相位信息的频谱支持域；最后利用合成孔径策略将不同照明角度下的埃瓦尔德球壳支持域进行合成，并进行三维传递函数反卷积和非负约束正则化等处理，即可实现三维折射率衍射层析重建。
生物样品三维折射率重建
为了验证TIDT-NSA对具有复杂结构的三维生物样品进行成像的能力，图6展示了全视场成像范围内秀丽隐杆线虫三维折射率衍射层析的重构结果，得益于系统轴向焦距扫描与多角度照明合成孔径，TIDT-NSA技术可实现横向分辨率为206nm，轴向分辨率为520nm的高质量无标记三维层析重构，且可实现在轴向重构深度超过100μm的范围内复杂三维结构及散射情况下的三维折射率层析成像。该线虫三维折射率重构结果证明了TIDT-NSA对结构复杂的厚生物样本具有较好的三维成像解析力与光学切片能力。
此外，研究人员还对动态HeLa细胞的三维折射率进行了重建，图7展示了细胞在生长过程中的形态及折射率分布变化。成像过程中只需204幅强度图像，且可实现30秒内一次完整的三维体折射率成像，整个动态观测时长达90分钟以上，且细胞整体形貌与内部细胞器结构细节都可以被清晰分辨，如细胞边缘处的丝状伪足和细胞内部核膜结构。细胞动态三维衍射层析结果说明了TIDT-NSA技术能够在无标记状态下对生物样品进行动态、非侵入、高分辨及高衬度的三维折射率层析成像。
未来展望
本文推导出了针对二维定量相位与三维衍射层析成像的普适传递函数表达式，并将光学传递函数理论与基于Kramers-Kronig的定量相位成像理论统一到了同一个理论框架中。相比较于Kramers-Kronig关系，本文所归纳总结的普适传递函数理论从另一个角度更加完备和直观地揭示了非干涉相位恢复与衍射层析理论背后的物理图景。更重要的是，该理论不受匹配照明条件的限制，可在任意相干态的照明条件下为定量分析定量相位成像与衍射层析成像系统的分辨率和对比度提供一个强大工具。基于此理论框架，提出了基于“三维光强传输”的非干涉合成孔径的光学衍射层析方法（TIDT-NSA），TIDT-NSA有机地结合了基于轴向离焦的光强传输与基于多角度照明合成孔径的思想，不仅将三维衍射层析的成像分辨率拓展至非相干衍射极限，还保持了对复杂厚样品的高衬度、抗散射、高轴向层析的成像能力。
未来重点需要解决的问题包括：对多层、多次散射样品的模型优化、减少数据采集量、提升成像速度等方面。此外将TIDT-NSA与三维荧光显微成像技术（如三维结构光照明超分辨荧光显微技术）相结合24，可为单细胞和亚细胞水平上观察活细胞内纳米尺度的细节打开新的窗口，有望为单细胞形态学与动力学分析、细胞相互作用、细胞反应、无标记病理诊断等应用领域提供更多的知识与更深的见解。
论文信息
Li, J., Zhou, N., Sun, J. et al. Transport of intensity diffraction tomography with non-interferometric synthetic aperture for three-dimensional label-free microscopy. Light Sci Appl 11, 154 (2022).
https://doi.org/10.1038/s41377-022-00815-7
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