德国海森堡大学分子系统工程与先进材料研究所Peer Fischer团队在《Nature Reviews Bioengineering》期刊发表文章“Ultrasound-assisted tissue engineering”, 人们将细胞、生物材料和生物活性因子与生物物理学刺激相结合，用于工程化细胞和组织结构，可解决各种应用，如再生医学和个性化医学，以及药物发现和测试。然而，与组装多种细胞类型和功能的大型复杂组织相关的挑战需要将已建立的技术（如3D打印）与细胞组装和细胞刺激方法相结合。超声波是推进组织工程的潜在工具，具有细胞相容性和深部组织穿透的优势。在这篇综述中，作者讨论了超声波在生物构建块的远程操作和组装中的应用，以及与超声波敏感添加剂相结合的细胞过程的直接和间接触发。此外，作者还探讨了超声波在组织成熟、影响微环境和细胞编程方面的作用。最后，作者概述了该技术面临的挑战，并考虑了超声波在组织工程中的广泛应用。
一、超声辅助组织制造
超声波是一种机械波，可以对细胞施加力并向周围介质传递能量。在组织制造中，声辐射力可以移动、排列和聚集细胞或粒子。此外，声波的粘性吸收可以导致声流动，并在液体中产生定向流动。这些流动可以通过拖曳实现营养物质和细胞的运输，并在高或低流速区域重新悬浮或聚集细胞。显然，这些机械效应有助于塑造功能性活体组织。
组织工程的三个基本构建块是细胞、支架材料和生物活性信号分子。工程化组织应该复制其天然对应物的行为：细胞附着、迁移、增殖、分化，并对不同的生物力学和生化信号做出反应。为了实现这一点，用于支架的生物材料必须提供适当的结构特征（例如孔径大小）和机械性能，以及细胞附着位点来引导特定的细胞功能。
由于天然组织的高复杂性和排列细胞组装所需的高空间精度，精确地从底层复制生理组织仍然不可行。然而，细胞自我组织的能力减少了所需的精度。使用含有组织特异性环境的生物墨水，包括支架前体和细胞。这些前体将形成初始的细胞外基质（ECM）或支架，可以是合成或天然来源。生物打印类似于添加制造，其中通过逐点或逐层沉积或固化细胞相容树脂来创建物体。通过顺序沉积多个生物墨水的小滴或线条，可以形成具有3D结构和梯度的复杂组织。另外，生物组装技术直接操纵生物墨水的组成部分，如空间重新排列支架材料或细胞，以创建异质结构。这两个概念之间的区别并不严格，两者可以并行或顺序应用。将这些方法与超声波相结合可以改善和加速组织制造过程。
图1 声波在生物组织的制造和成熟过程的应用
二、超声辅助生物3D打印
生物打印技术包括挤出打印、液滴传输（例如声波、激光或气动）或选择性光诱导聚合（例如立体光刻、双光子光刻或层析法）。尽管可应用的生物打印技术不断扩展，现有技术的打印参数也在迅速改进，但仍有改进空间，特别是需要解决关键挑战。例如，打印速度受到限制，与分辨率和复杂性成反比。此外，细胞间的接近度和细胞密度仍然较低且难以控制。此外，机械力和长时间的打印导致细胞损伤增加，打印构件的存活率降低。
解决打印速度和低细胞密度的常见方法是将高细胞密度的聚集体（如球体或富含细胞的微凝胶）纳入生物墨水中。这些聚集体提高了初始细胞间接触，从而促进了组织的成熟。此外，打印微凝胶时形成的微观空间有助于营养物质扩散和细胞分化、增殖和迁移等基本细胞过程。聚集体可以通过其他生物制造方法进行准备，例如自组装聚集、细胞成片、微流控制造或3D直接细胞打印。类似地，生物打印技术还可以通过将细胞微图案技术整合到打印过程中来加强。声波可以在生物墨水挤出期间或之后应用，以改变分散活细胞的空间分布。将细胞聚焦和排列在挤出之前可减小打印细胞结构的特征尺寸。此外，细胞的聚集增加了与生物墨水相比的局部细胞密度，并可以改善特定组织的形成，例如肌肉纤维和血管系统。声波可以在打印喷嘴内激发成一条或多条线，其频率被选择为使喷嘴通道跨越生物墨水中半声波波长的整数倍。此外，预先对细胞进行排列还可以减轻使用锥形喷嘴尖端时的堵塞。另一种方法是，生物打印机将生物墨水沉积到含有水凝胶前体的浴缸中，然后在基质聚合之前通过声波生成的声站波进行细胞图案化。此技术用于将人脂肪源干细胞图案化为单层和多层明胶甲基丙烯酸酯水凝胶构造中的平行线条。
超声波可用于细胞和颗粒的组装。它可以通过声辐射力直接作用于细胞，或通过声流引起的拖动间接作用于细胞。此外，声辐射力无需标记、无需接触，且距声源距离大（几厘米）。声波在组织中的衰减较低，如果强度保持在生物医学用于推荐的安全限制内，不会对细胞产生毒性。
三、超声定向生物组装
近年来，定向生物组装方法作为一种替代策略出现，以改善细胞存活率和细胞间相互作用，以模拟自然生物过程。生物组装直接作用于生物墨水的个体组分，而不是整体，一些技术（包括磁性和声波组装）通过并行组装实现可扩展性。与生物打印的组织构造相比，这些组装体可以达到更高的细胞密度，甚至接近堆积（生理水平）。一个例子是通过吸入式工具将球体在屈服应力凝胶中装配成一系列单个球体。然而，这种技术的扩展性非常有限，因为吸入工具一次只能将球体移动到目标位置。
细胞组装的声辐射力可以通过超声驻波获得，最常见的形成方式是由对立的声源对或由单个声源激发的共振腔或微通道。这些系统中的辐射力通常在约1 pN到约10 nN之间。生物细胞在生长介质中表现出轻微的正声对比度，因此被推向声压节点。压力节点的固定空间位置，结合强力量，通常导致组装模式的高保真度，尽管限于少数高度对称和周期性的模式。然而，由于声对比度是细胞和周围液体介质的密度的函数，可以通过添加溶质（例如对比剂碘庚酮）来调整，以提高或取消声对比度，从而改变辐射力的幅度和方向，从而分离细胞。细胞向节点点聚集可用于在共振生物反应器或微孔中组装和培养球体。通过微加工创建的硅片上的100个微孔阵列允许肿瘤模型的并行组装，以及它们的培养和直接功能成像。
许多组织从细胞间结构的异质形成中获得功能，例如肌肉纤维。这引出了一个基本问题：简单的几何细胞组装是否足以指导这些结构的形成和发展。这在超声驻波中的肌样细胞中进行了探索。在那里，肌样细胞聚集成带状，固定在甲基明胶中培养七天。与对照组相比，图案化样本显示了8倍上调的肌原激素调节因子（MRF4）表达和形成更长的肌管，与压力节点对齐。同样，软骨细胞的组装和培养35天导致了类似于深层区域结构的软骨组织。在这两个实验设置中，超声换能器被布置成在侧向发射声波，其中腔体的侧向尺寸约为液体高度的三倍。通过增加腔体的高度和改变声波照射方向，可以实现3D构造。谐振条件限制了产生的组装物到周期性间隔的片、线和斑点，例如多层神经组织，或由内皮细胞形成的血管网络。此外，基于超声波的组装通过增加局部细胞密度促进了血管的功能成熟，从而支持了紧密连接。
图2 超声场的塑造及其用于定向组装
四、超声辅助组织成熟
超声波可以通过操纵细胞外环境的力学或结构来间接影响细胞表型。除了细胞从周围环境接收到的大量生化信号外，被动和主动的生物物理因素也是细胞生理的重要决定因素。细胞能够感知被动生物物理因素，如细胞外基质的几何形状、拓扑结构和粘弹性，以及作用于它们的不同类型的力。这些因素调节了细胞骨架的组织、肌肉肌凝集力、染色质重塑和差异转录谱，从而决定了细胞表型。因此，通过控制支架引入的生物物理因素是引导细胞介导的组织成熟的强大策略。
超声刺激可以通过在形成组织的特定区域进行远程触发和定向应用来根据需要改变细胞外环境。超声对介质的热力学或机械作用可直接调节细胞外基质的结构。间接调节需要在超声刺激过程中加入超声响应性添加剂，如微泡、抗泡和脂质体，这些添加剂可以将超声效应转换或放大以引发细胞外基质的响应。目前，超声辅助的动态调节物理微环境和组织成熟过程中的细胞生理作用尚不多见；然而，以下所述的工作展示了这种调节的潜力。
超声可以影响天然细胞外基质材料的结构，最早是在1993年通过超声降解血纤维蛋白凝块中首次展示的。声辐射也可以通过热效应调节胶原纤维的结构，从而调节细胞迁移。然而，只有在胶原自组装过程中施加超声时才存在这种效应。将已组装的胶原凝胶暴露于类似能量水平的超声中不会导致水凝胶重塑，从而限制了其后制造应用。
与天然材料相反，合成支架可以通过包含特定设计的功能性和响应性元素来使其对超声作出响应。例如，已经探索了超声触发的水凝胶药物释放。超声响应性也可应用于调节支架的粘弹性。支架降解或软化可以通过在支架中的易逝键的断裂来触发，以适应细胞增殖带来的细胞数增加。类似地，通过聚合物酶敏感的交联物内部使细胞间迁移和扩展成为可能。此外，通过集中的光照刺激使光敏交联物降解，这表明超声敏感交联物可以类似地用于创建动态支架。
总体来说，利用超声通过调节细胞封装的不溶性微环境来影响组织成熟仍处于初级阶段。它显示了在指定的组织工程方案中应用的潜力。未来的研究应考虑超声对工程支架的直接影响。超声与细胞的相互作用，无论是直接还是间接的，都可能导致细胞行为和生长的各种变化。
五、远程触发的细胞重编程
远程触发的细胞重编程是通过超声波直接或间接地刺激细胞，以及利用超声响应添加剂介导细胞再编程的技术。这些方法包括热、机械、化学和声遗传刺激，可以通过细胞信号传导和自组织功能引入宏观生理变化。超声波可以通过吸收热能、振动、辐射力、空化或声流等热力学或机械效应直接刺激细胞。此外，还可以间接地利用超声波响应材料来增强超声波的效应。这些方法可以在细胞内或周围介质中引发生物学效应，促进细胞的重编程和功能性变化。
图3 超声波用于细胞成熟和重新编程
总结：超声波是一种多功能方法，可以推动细胞和组织的结构与功能，在未来的组织工程中发挥重要作用。尽管组织工程面临复杂挑战，但超声波有望与传统方法结合，改善组织制造和成熟。超声波技术已取得进展，可用于3D模式化细胞和构建物，动态操纵支架材料的物理性质，以及控制细胞内外信号分子和基因表达。然而，仍需进一步研究超声波与生物组织之间的相互作用机制，并全面系统地表征超声场和实验参数。通过发展和整合不同方法，超声波有望在组织制造和成熟方面发挥重要作用，促进工程化组织的复杂性、可重复性和可扩展性，从而减少动物实验，推动个性化和再生医学的发展。
文章来源：https://doi.org/10.1038/s44222-024-00166-5
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