基于代谢组学方法研究银耳多糖对非酒精性脂肪肝大鼠的干预作用- 大数跨境

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基于代谢组学方法研究银耳多糖对非酒精性脂肪肝大鼠的干预作用

食品工业科技编辑部

2021-07-09

基于代谢组学方法研究银耳多糖对非酒精性脂肪肝大鼠的干预作用

——吉林化工学院张艳副教授

研究背景

高血脂又称脂质代谢异常，主要是指血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）或血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）水平过高和/或血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）水平过低，是常见的代谢性疾病。研究发现，高脂饮食引起的脂质代谢异常伴有肝脏脂肪变性（被称为非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD））的病变过程，严重的NAFLD很容易发展为非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化等疾病，因此控制血脂可在一定程度上可有效预防NAFLD。现今，他汀类、贝特类等化学药物是治疗高血脂类疾病的常规药物，虽然这些化学药物疗效显著，但副作用明显，如肌痛、横纹肌溶解症和肝功能异常等。因此，开发天然的降脂保肝功能性食品的需求日益增加。

银耳（Tremella）属于真菌类银耳科银耳属，是门担子菌门真菌银耳的子实体，作为绿色食品的典型代表，具有较高的营养价值、巨大的经济价值与开发潜力。银耳多糖是银耳中重要的活性物质，现代研究表明，银耳多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降糖及免疫调节等多种作用，然而银耳多糖对NAFLD的干预作用和机制研究却鲜有报道。

代谢组学是一种快速对生物体内所有低分子量代谢物代谢产物进行定性、定量分析，并寻找代谢物与生理变化相对关系的学科，是系统生物学的重要组成部分。近年来，代谢组学在食品、营养科学和中医药领域的应用越来越广泛，为以天然产物为基础开发的功能性食品作用机制及其理论研究提供了强有力的现代化研究手段。张艳课题组借助于气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术分析NAFLD模型大鼠肝组织小分子代谢物，并通过主成分分析（principal components analysis，PCA）和正交信号校正偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）模式结合代谢组网络数据库，寻找银耳多糖干预NAFLD大鼠肝匀浆的生物标志物及作用的代谢通路，为开发银耳多糖为降脂保肝功能性食品提供理论依据。

1 银耳多糖对NAFLD大鼠血脂和肝功能指标的影响

根据《中国成人血脂异常防治指南》，TG≥1.70 mmol/L为高TG血症，TC≥5.18 mmol/L为高TC血症，LDL-c≥3.37 mmol/L为高LDL-c血症，HDL-c≤1.04 mmol/L为低HDL-c血症，符合其中任一项即为血脂异常。此外，ALT和AST的含量是血清中提示肝损伤的重要指标。由表1可知，与空白组比较，模型组血清TC、TG、LDL-c、AI、LDL−c/HDL−c及TC/HDL−c水平极显著升高（P<0.01），HDL-c水平显著下降（P<0.05），与此同时，ALT、AST和ALP水平极显著升高（P<0.01），表明大鼠NAFLD模型建立。与模型组比较，银耳多糖组血清TC、AI、LDL−c/HDL−c及TC/HDL−c水平极显著降低（P<0.01），TG和LDL-c水平显著降低（P<0.05），HDL-c水平显著升高（P<0.05），ALT、AST和ALP水平显著降低（P<0.05），表明银耳多糖具有明显的降脂保肝作用，可以改善NAFLD大鼠的血脂异常和肝功能异常。

2 组织病理学检查

病理结果（图1）表明，空白组大鼠的肝组织结构正常，肝小叶结构清晰，肝组织细胞清晰可见，无脂肪组织增生；模型组肝细胞脂肪变性明显，伴有炎性细胞浸润和脂肪结缔组织增生；银耳多糖组的肝组织细胞情况有明显改善，肝组织细胞相对清晰、部分肝细胞表现为弥漫脂肪变性及胞浆疏松化，但大部分肝细胞结构正常。由此可见，银耳多糖可降低大鼠肝脂肪蓄积，减轻肝脏的脂肪变性程度。

3 代谢组学分析

3.1 各组肝匀浆代谢轮廓分析

如总离子流（TIC）图（图2）所示，3组大鼠肝匀浆中代谢物均得到良好的分离，色谱峰保留时间主要集中在6~45 min，且有明显的不同，表现在代谢物的保留时间及峰面积上的差异。为了进一步检测空白组、模型组和银耳多糖组大鼠代谢轮廓的变化情况，对3组大鼠肝匀浆代谢谱的数据进行PCA分析（图3）。由PCA图可以看出空白组、模型组和银耳多糖组能够分开并且呈明显的聚类特征。模型组的样本远离空白组的样本，而银耳多糖组样本更接近于空白组，说明银耳多糖对NAFLD大鼠的异常代谢轮廓有的调节作用，更趋近于空白组。

3.2标志物的鉴定

在OPLS-DA（图4A和4C）图中，空白组和模型组可以明显分为两部分，模型组和银耳多糖组也可以明显分为两部分，表明组间差异远远大于组内差异。在S-plot（图4B和D）中，S型两端的点为潜在的生物标志物，同时以VIP>1.0和P<0.05作为生物标志物的判断标准。通过匹配NIST(http://webbook.nist.gov/chemistry/)，METLIN（https://metlin.scripps.edu/），HMDB（http: //www. hmdb. ca/）和KEGG（http: // www. genome. jp/ kegg/）数据库和查阅相关文献，最终确定12个银耳多糖治疗酒精性脂肪肝的内源性代谢物为潜在的生物标志物（表2）。其中，与空白组比较，模型组苹果酸，延胡索酸，D-葡萄糖，柠檬酸，D-核糖，丙酸，辛二酸，顺-乌头酸和乙酰乙酸水平显著升高（P<0.05），甘氨酸、山梨醇和D-葡萄糖醛酸水平降低（P<0.05）。与模型组比较，银耳多糖组苹果酸、延胡索酸、D-葡萄糖、柠檬酸、D-核糖、丙酸、辛二酸、顺-乌头酸和乙酰乙酸水平降低（P<0.05），甘氨酸、山梨醇和D-葡萄糖醛酸水平升高（P<0.05）。上述结果表明，银耳多糖对12个生物标志物的异常水平均具有显著的逆转作用，能够使得它们的表达趋于正常水平。

3.3 代谢通路分析

通过MetaboAnalyst（https://www.metaboana

lyst.ca/）的代谢通路分析筛选影响因素大于0.1的代谢通路为主要影响的代谢通路。如图5所示，这12种标志性代谢物主要涉及酮体的合成和代谢，乙醛和二羧酸代谢，抗坏血酸和醛酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，TCA循环和丁酸代谢等6种代谢途径。

NAFLD是可影响多个器官的代谢综合征，肝脏是第一个被积累的器官，最初表现为肝脂肪，继而引起包括线粒体功能障碍的继发效应，如氧化损伤和脂肪细胞因子失衡等。肝细胞内脂肪的大量沉积导致的氧化损伤是在NAFLD的病理过程起关键作用。氧化损伤可导致肝脏线粒体功能障碍并直接导致ATP的生成障碍。TCA循环是碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢的重要枢纽，也是能量代谢产生ATP的重要途径。苹果酸、柠檬酸、延胡索酸和顺-乌头酸是TCA循环的主要产物。丙酸是丙酮酸代谢的中间体，通过参与丙酮酸代谢间接影响体内ATP的生成。D-核糖是ATP的结构组成部分，其水平间接反映体内能量代谢产生ATP情况。D-葡萄糖是机体直接利用的能量来源。山梨醇参与乳酸代谢途径也影响能量代谢。如表2所示，与空白组比较，模型组上述生物标志物水平均明显升高，表明模型组大鼠能量代谢异常。此外，苹果酸、柠檬酸和顺-乌头酸也参与乙醛酸和二羧酸代谢。模型组苹果酸、柠檬酸、延胡索酸、顺-乌头酸、丙酸、D-核糖和D-葡萄糖水平升高，山梨醇水平降低，表明模型组能量代谢异常的同时乙醛酸和二羧酸代谢也出现了异常。经银耳多糖治疗后，这些生物标志物水平有所恢复，表明银耳多糖可以调节能量代谢和乙醛酸和二羧酸代谢异常。

长期高脂肪饮食可增加脂肪含量，从而增加血液中的游离脂肪酸水平，进而导致肝脏游离脂肪酸的大量涌入造成过高的肝脏TG浓度和高TG血症。酮体是脂肪酸在肝脏进行正常分解代谢所生成的特殊中间产物，乙酰乙酸是其代谢产物。正常生理情况下，酮体及其代谢产物在体内的含量很低。NAFLD病理状态下，蓄积的脂肪导致脂动员增强，脂肪酸分解，肝脏中酮体及代谢产物的水平也会增加，甚至还会引起酸中毒。乙酰乙酸也参与丁酸代谢。丁酸代谢上的许多物质最终用于生产酮体。此外，辛二酸也是脂肪酸的代谢产物。模型组肝脏乙酰乙酸和辛二酸水平明显升高，表明模型组肝脏脂肪酸分解代谢加强，酮体的合成和代谢明显增加。经银耳多糖治疗后，乙酰乙酸和辛二酸水平有所降低，表明银耳多糖可以通过调节异常的酮体的合成和代谢，抑制脂肪酸分解，减少肝脂肪蓄积，减轻肝脏的脂肪变性程度。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）在NAFLD发展和恶化中起关键作用。ROS可以过氧化膜磷脂和蛋白质产生严重的细胞氧化损伤。正常生理条件下，机体ROS和抗氧化剂的水平保持动态平衡，然而，NAFLD患者体内则出现ROS水平升高或抗氧化剂水平降低的情况。谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是体内清除ROS的重要物质之一。甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸是合成GSH的原料。甘氨酸是甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢上的重要产物，其水平的降低间接影响GSH的合成和机体的抗氧化能力。D-葡萄糖醛酸是抗坏血酸和醛酸代谢途径上的物质。抗坏血酸和醛酸代谢也是和保肝作用有关的代谢[30]。模型组甘氨酸和D-葡萄糖醛酸水平降低表明NAFLD大鼠抗氧化能量降低。给予银耳多糖后，甘氨酸和D-葡萄糖醛酸水平上调，表明银耳多糖还可以通过调节甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢和抗坏血酸和醛酸代谢水平改善机体的氧化损伤，增加抗氧化能力，发挥保肝作用。

4 结论

银耳多糖可降低NAFLD大鼠血清TC、TG、LDL-c、ALT、AST和ALP水平，增加HDL-c水平，并可降低NAFLD大鼠肝脂肪蓄积，减轻肝脏的脂肪变性程度。其作用机制与调节12种生物标志物（苹果酸、山梨醇、甘氨酸、D-葡萄糖醛酸、延胡索酸、D-葡萄糖、柠檬酸、D-核糖、丙酸、辛二酸、顺-乌头酸和乙酰乙酸）所对应的6条主要代谢通路（酮体的合成和代谢，乙醛和二羧酸代谢，抗坏血酸和醛酸代谢，甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢，TCA循环和丁酸代谢），使其向正常状态转变有关，从而缓解NAFLD大鼠代谢紊乱的症状，发挥降脂保肝功效。

通信作者简介

张艳副教授

沈阳师范大学粮食学院

吉林化工学院化学与制药工程学院

张艳，女，博士、学术骨干、吉林省第七批拔尖创新人才、吉林省高校春苗人才、吉林省药学会药理专业委员会委员、中国化学会会员。2018年以第一负责人获吉林省自然学术成果奖三等奖，同年，获吉林市科技进步奖二等奖。研究方向主要有两方面：1.天然产物生物活性与毒性。将天然药物化学与药理学相结合，开展中药材、天然产物有效部位、天然产物有效成分的生物活性研究（药效学研究）和急性毒性、长期毒性及特殊毒性研究，为新药上市前的药效学研究和安全性研究提供理论依据，并为科技成果的产业化、工业化提供前期准备工作。本研究方向的两个子方向：（1）天然产物有效部位（有效成分）的分离和纯化及生物活性研究；（2）天然产物毒性研究；2.天然产物作用的分子机制及靶点。采用药理学和生物化学与分子生物学手段准确开展中药材、天然产物有效部位、天然产物有效成分作用的分子机制，探索生物活性物质作用的信号转导通路及深层次作用靶点。

近年，在SCI收录、中文核心期刊等学术期刊发表论文10余篇；申请、参与国家自然科学基金、吉林省科技厅、吉林省教育厅、吉林市科技局等各类项目10余项；参与申请国家发明专利多项。

代表性论文：

[1] Yan Zhang，Haitao Li，Lianlian Song，Jianfei Xue，Xinyan Wang，Shuang Song，Shuang Wang.Polysaccharide from Ganodermalucidum ameliorates cognitive impairment by regulating the inflammation ofthe brain-liver axis in rats[J].Food & Function, 2021.

[2] Yan Zhang, Shuang Wang, Shuang Song, Xiaomei Yang, Gang Jin. Ginsenoside Rg3 Alleviates Complete Freund’s Adjuvant-Induced Rheumatoid Arthritis in Mice by Regulating CD4+CD25+Foxp3+Treg Cells[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020 68 (17), 4893-4902.

[3] Yan Zhang, Xiaomei Yang, Shuang Wang, Shuang Song. Ginsenoside Rg3 Prevents Cognitive Impairment by Improving Mitochondrial Dysfunction in the Rat Model of Alzheimer’s Disease[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 2019 67 (36), 10048-10058.