近日，新加坡南洋理工大学Chen Yu-Cheng（陈又诚）教授课题组联合澳大利亚悉尼科技大学房国成研究员，提出了一种超灵敏的微流控“激光水滴”，用于高通量生物反应的高效监测。该工作以“Laser-emitting aqueous bioreactors for ultrasensitive bioactivity analysis”为题，发表在《PNAS》杂志。论文第一作者为悉尼科技大学房国成研究员和南洋理工大学博士生Po-Hao Tseng。通讯作者为Chen Yu-Cheng 教授。该工作还得到了圣路易斯华盛顿大学Lan Yang教授和Jie Liao 研究员、悉尼科技大学金大勇院士、以及加州大学旧金山分校Hangrui Liu研究员的支持。
微流控液滴技术被誉为“试管革命”，能把细胞、酶、药物分子封装在皮升级水滴里独立反应，并借助荧光信号进行高通量检测。然而，荧光方法依赖探针与靶标的 “弱” 相互作用，背景噪音高、灵敏度有限。为了再放大信号，科学家把目光投向激光：当光在微球或微管里绕圈形成WGM共振，会形成受激辐射产生激光，微弱的生化变化与激光相互作用，可引起激光波长、阈值、强度等“光学指纹”的明显变化。
水滴是天然的光学微腔，早在上世纪70年代，就有科学家将水滴暴露在空气中，开发成水滴激光器。但是，水滴因折射率低，一直只能在空气中做“短命”激光— 蒸发不到100秒就干涸，激光信号也极其不稳定。有人尝试把水滴浸到油里，但又必须在水滴中掺入70%甘油来提升水滴折射率，结果高黏度限制了生物活性。
本文提出“激光发射水相微反应器”（LEAB）：把含荧光染料的水滴包进氟碳油（折射率≤1.29）里，既防蒸发，把水滴寿命延长1000倍以上，还能保持激光稳定输出。LEABs实现生物反应与最强共振光场在空间上高度重合，灵敏度比传统WGM传感器高100倍；再和微流控滴液技术结合，一次能做上千个并行实验。作者用它做单细胞酶动力学、肿瘤单细胞\细胞球代谢、甚至单酵母β-葡萄糖苷酶分泌的高通量筛选—只凭激光阈值就能“开/关”式分选。该平台把微型激光技术真正下沉到生化实验室，为超灵敏、高通量、低成本的生物活性分析打开新大门。
图1：LEAB概念示意。（A）水相液滴（含染料）被氟碳油包裹，形成WGM激光微腔；氟碳油折射率小于水折射率。谐振光场大部分被束缚在水滴中，与里面的生化反应发生作用，引起激光光谱的变化。（B）通过微流控可大规模生产含类器官/细胞/酶/分子的激光水滴，实现高通量、长时程监测。图源：PNAS
图2：单乳液LEAB光学表征。（A）微流控制备的均匀水滴荧光图。（B）水滴激光图像：每个水滴在相同泵浦下均一发光。（C）泵浦强度递增时的激光光谱。（D）光谱积分强度-泵浦能量曲线，表现出激光明显的阈值特性。（E）随水相折射率增加，可支持激光产生的液滴最小直径从65 μm降至18 μm。图源：PNAS
图3：双乳液LEAB激光行为。（A） W/O/W双乳液：单/双/三核水滴均可激光，激光出现在非接触位置。（B） O/W/O双乳液：水壳层同样支持激光产生。（C）三类构型阈值比较：单乳液最低，W/O/W最高。（D）水相折射率越高，维持激光所需壳层厚度越薄。（E）32μm直径O/W/O水滴激光谱。图源：PNAS
图4：超高灵敏无标记酶活检测。（A）三种WGM传感器光场分布比较：聚苯乙烯微球、玻璃毛细管、LEAB。LEAB可实现大部分光场与反应区完全重叠，因此保证了高灵敏特性。（B）理论波长漂移-折射率关系：LEAB灵敏度达373 nm/RIU，比传统方案提升>100倍。（C）高通量微孔阵列：每个孔一个激光水滴，实时监测胰蛋白酶水解BSA。（D）1小时内激光波长红移6 nm，反应动力学清晰可见。（E）微孔阵列反应可视化。（F）统计曲线：70分钟漂移饱和，平均6.4 nm，对照无漂移。图源：PNAS
图5：单细胞/多细胞代谢分析。（A）反应原理：细胞代谢产乳酸，pH下降，进而引起FITC激光强度变化。（B）单细胞封装：红色染料标记细胞，绿色为激光。（C）不同pH下FITC荧光响应。（D）不同pH下FITC激光响应。(E) NHDF与A549单细胞激光强度差异，反映细胞间代谢速率的异质性。（F）包含A549细胞球的液滴激光。（G）细胞球体积与激光强度关系（体积越大，酸化越严重）。
图6：单酵母β-葡萄糖苷酶分泌阈值分选。（A）非荧光FDGlu被酵母BGL水解为可发荧光的荧光素，进而产生激光增益。（B）单酵母封装示意。（C）24小时后，不同酵母产生的荧光。（D）包含单个酵母的水滴激光照片。（E）激光光谱示例。（F）不同酵母水滴激光阈值差异显著（35–79 μJ/mm²）。（G）通过调节泵浦强度实现阈值门控筛选：55.6 μJ/mm²时Ⅰ、Ⅱ亮，45.1 μJ/mm²仅Ⅰ亮，完成高分辨筛选。
本研究把“激光”与“微流控水滴”两个看似独立的领域合二为一，创造了一种既能在油里长期发激光、又能直接感知生化反应的“激光水滴”平台。LEAB解决了困扰水滴激光50年的蒸发与折射率双重瓶颈：氟碳油包封不仅阻断蒸发，还把水-油界面变成天然高Q谐振腔；无需甘油增稠即可实现低阈值激光，使任何生物液体都可直接“变身”激光器。技术层面，LEAB带来的灵敏度飞跃源于光场-反应区高度重叠，打破了传统WGM传感器依赖微弱“消逝场”的物理限制；再辅以微流控批量制造，实现了单分散、高通量、可阵列化，为真正的“芯片上的激光实验室”铺平道路。
总的来说，LEAB把“激光”这一曾经昂贵、笨重的技术，压缩成一颗可以握在手心的水滴，既保留了激光超高灵敏度的优点，又兼具微流控高通量、低成本的特色，真正实现了“让每一滴水都成为一座激光实验室”的愿景。
https://doi.org/10.1073/pnas.2425829122
