研究背景
1 酶法提取多糖原理及其影响因素
1.1 酶法提取多糖的原理
酶法提取多糖的原理在于酶的特异性催化作用,且与酶作用于底物化学键位的选择性有关。酶可以选择并针对性地降解植物、藻类以及微生物的细胞壁和细胞膜(如淀粉、纤维素和果胶等主要细胞成分),减少溶剂提取时来自细胞壁、细胞膜和细胞间质的阻力,使有效成分得到释放,同时酶的使用也可将部分多糖降解为更小分子量的片段,从而更有利于多糖从细胞内分离出来。酶法提取多糖常见的酶有纤维素酶、果胶酶、蛋白酶,具体使用种类要根据不同的底物而定。例如植物的细胞壁成分是由纤维素、半纤维素、果胶质、木质素等物质构成，则一般需要纤维素酶和果胶酶;而动物细胞膜一般由脂质与蛋白质构成,一般由蛋白酶水解,例如星虫科的方格星虫,肉质脆嫩,含有丰富的蛋白质多糖复合物类活性物质,需要采用胰蛋白酶进行酶解。半纤维素、果胶质、木质素等物质构成，则一般需要纤维素酶和果胶酶;而动物细胞膜一般由脂质与蛋白质构成,一般由蛋白酶水解,例如星虫科的方格星虫,肉质脆嫩,含有丰富的蛋白质多糖复合物类活性物质,需要采用胰蛋白酶进行酶解。
1.2 酶法提取多糖影响因素
酶法提取多糖的效率一般与温度、pH、底物浓度酶浓度、提取时间、抑制剂及激活剂等因素相关，通过预试验一般可以获得相关因素的酶解最适条件。
1.2.1 温度和pH
每一种酶都有一个最适的温度范围,但它不是固定的,其大小受作用时间﹑底物种类等影响,并且过高或过低的温度都会降低酶解效率。同样过高或过低的pH也会造成酶解效率的下降,原因是pH的不适会引起酶蛋白质构象的改变,从而导致了酶的变性;即使pH的不适未引起酶的变性,但其同样会影响酶与底物的解离过程,从而降低酶活性,不利于催化产物的形成。此外,酶构象的活性位点或官能团区域可能会因为pH的调节而改变。
1.2.2 底物浓度和酶浓度
当底物过量时,反应到平衡后,酶解效率不会因为底物浓度的增加而增加;而酶解时间会因为酶的不足而延长,当加酶量多时,底物的稀缺会造成酶与酶之间出现竞争底的现象,从而抑制酶的催化作用,同时也会造成酶浪费。
1.2.3 提取时间
提取多糖时间的长短也会影响催化效率,当酶解时间过短时,酶与底物的反应会不充分,从而导致产物的提取率较低;当酶解时间过长时,酶促反应完成后,产物提取率不会随着时间的延长而增加,当酶足量时,随着酶解时间的延长,多糖甚至会被酶降解为单糖，得率反而下降。
1.2.4 抑制剂及激活剂
抑制剂会与酶进行可逆或不可逆的结合,从而抑制酶的催化作用。当酶的活性基团与抑制剂以共价键的形式牢固结合时,酶的活性会丧失,超滤、透析等方法也无法除去抑制剂以恢复酶的活性,此为不可逆结合。可逆结合可分为竞争性抑制作用、非竞争性抑制作用和反竞争性抑制作用。竞争性抑制作用为抑制剂与酶所作用的底物结构相似,可与底物共同竞争酶的活性位点;非竞争性抑制作用为抑制剂与底物可同时结合在酶的不同部位,形成酶-底物-抑制剂三元复合物,使反应终止;反竞争性抑制作用为酶与底物形成络合物后才能与抑制剂结合,结果同样使反应终止。与不可逆结合不同的是,可逆结合可通过物理的方法去除抑制剂,并恢复酶活性。酶的激活剂大多都是金属离子或者其他无机离子,某些还原剂也能激活特定的酶,使酶中二硫键还原成硫基从而提高酶活性;但激活剂也有其最适浓度,过多也会造成对酶的抑制作用。
2 酶法提取多糖技术
目前酶法提取多糖的技术主要有单酶法、多酶法、酶法提取技术与其他技术的联用三大类。本文将根据相关研究的最新进展对这几种方法进行介绍和比较。
2.1 单酶法提取
单酶法是指只利用一种酶来酶解原料从而获取多糖的方法,经常使用的酶包括纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等。纤维素酶是一种可以酶解纤维素的β-D-葡萄糖苷键,破坏植物的细胞壁,从而释放出多糖等有效成分的酶。蛋白酶是一种可以水解生物体内游离的蛋白质,使蛋白质的结构变得松散的酶;蛋白酶还可以水解糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质，降低蛋白质对原料的结合力,使得多糖的浸出变得有利。目前多糖提取中常用的蛋白酶有胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶。果胶酶是一种作用于果胶复合物的酶的总称,包括果胶甲酯酶、聚半乳糖醛酸酶和果胶酸裂解酶三种。如表1所示,通过总结可以看出,单一酶提取多糖的条件和得率会随着提取物的不同而表现出较大的差异,相同的多糖水解酶在酶解不同底物时的最适pH和温度仍然表现出了一定的规律性,纤维素酶的最适pH在4.5~6.0,温度在50 ℃左右;胰蛋白酶的最适pH在8.O~8.6 ,温度在37~60℃ ;中性蛋白酶的最适温度在40~54 ℃;木瓜蛋白酶的最适pH在4~6.6,温度在50~55℃;果胶酶的最适pH在3.0~5.0 ,温度在40~60 ℃。单酶法提取多糖得率与传统热水提取多糖得率相比并没有突出优势,甚至多糖提取率会略低于热水提取,因此单酶法提取不适合用于多糖生产,一般是作为预实验来观察提取效果或者作为多酶法提取正交设计实验的单因素实验来进行研究。
2.2 多酶法提取
多酶法提取包括复合酶法提取和分段酶法提取,多酶法提取中酶种类的选取一般依据提取物细胞壁、细胞膜的成分或者其多糖与所结合蛋白质的性质。复合酶法提取即选用两种或多种酶,并按照一定比例进行组合优化后,同时作用于提取物,以起到增加酶解效率和多糖提取率的效果。复合酶法的酶配比、加酶量、温度、pH等最优条件的研究一般是在单酶最适条件研究的基础上,通过正交试验或响应面试验等来确定。夏平等以桑叶多糖为研究对象,以纤维素酶和果胶酶(质量比为1:1)为复合酶,多糖提取率高达14.32% ,是王芳等采用单一纤维素酶(12.49%)法提取率的1.11倍。于翠芳等采用复合酶法(蛋白酶:纤维素酶:果胶酶=1:1:1)提取枸杞多糖,提取率为13.96% ,是吴素萍等采用单一纤维素酶(11.20%)法提取率的1.25倍。张艳等]采用复合酶法(纤维素酶:木瓜蛋白酶=1∶1)提取香菇多糖的提取率高达13.25% ,是王文文等采用单一纤维素酶(4.16%)提取法的3.19倍。以上的研究表明,优化后的复合酶法可提高多糖的提取率,但还需优化酶的合理配比以及酶种类组合,如提取洋葱多糖过程中李建凤等采用纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶(较优配比为18:5∶10)的复合酶法的提取率为3.75% ,明显小于陈曦等采用纤维素酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶(2:2:1)为复合酶的研究(18.75%) ,也同样小于曹芮等采用胰蛋白酶单酶法的提取率(13.10% )。
分段酶法提取中酶的加入顺序、每种酶的作用时间等都会对提取效果有影响。分段酶法提取中酶的添加顺序一般是通过研究酶的不同加入顺序对多糖提取的效果来确定,同时各酶分段使用的最优条件是在单因素实验研究的基础上通过正交试验或其它试验来获取。王艳等采用纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶提取姬松茸多糖,在采用均匀设计法获取各单酶最适条件的基础上进行复合酶法和分段酶法研究,分段酶法研究中酶的添加顺序按照三种酶的排列组合即6种顺序依次研究对多糖提取的效果,结果显示,分段酶法多糖得率均高于复合酶法(11.65%) ,也高于热水提取法(7.69%);酶的最优添加顺序为先添加果胶酶,然后添加纤维素酶,最后添加木瓜蛋白酶,并且每种酶的作用条件均是其最优条件,最终多糖提取率为13.42% ,但通过对比6种添加顺序对多糖得率的影响发现