龚雯 硕士研究生
宁恩创 副教授
研究背景
多糖是一类广泛存在于多种动植物及微生物中的生物大分子，通常由10个以上的单糖通过糖苷键链接而成。多糖作为具有天然活性的高分子聚合物，如何被人体消化及利用以发挥其功能活性逐渐成为近年来多糖领域的研究热点。由于内窥镜、磁共振成像、动物模型等体内研究价格昂贵且探索范围有限，体外消化模型和粪便酵解方法的建立能够更简便、更可控、更直观地展现食物消化及吸收过程。研究表明，非淀粉类多糖并不会被唾液降解，部分植物多糖会在胃液、肠液中部分降解。因此，这类多糖能够较为完整地通过消化系统到达大肠，且肠道微生物能够较完全地利用多糖，从而促进益生菌增殖、抑制致病菌生长，并产生对人体有益的短链脂肪酸（Short-chain fatty acids, SCFAs）。SCFAs对人体具有诸多功能作用，不仅能被肠道上皮细胞提供能量，维持电解质平衡，还具有抗炎、预防肥胖、预防糖尿病、预防非酒精性脂肪肝、预防结肠癌等重要作用。
金花茶（Camellia nitidissima Chi）属山茶科山茶属，是我国特有属种的植物，主要分布于广西壮族自治区防城港市。研究表明，金花茶多糖具有护肝、降血脂、抗氧化活性等功能活性。目前，尚未有对金花茶多糖体外消化及酵解特性的研究报道。多糖结构的完整性是多糖在大肠中发挥功能活性的基础，而肠道微生物对多糖的分解是人体利用多糖的重要途径。因此，宁恩创团队研究金花茶多糖的消化及酵解对金花茶功能作用的发挥尤为重要。本文建立了体外消化模型及人体粪便酵解方法，探讨分级纯化后的金花茶多糖体外消化及酵解特性，旨在为金花茶多糖益生元产品的开发提供理论依据。
1 金花茶多糖的分离纯化
通过DEAE-52纤维素柱层析分离金花茶多糖，得到洗脱曲线图1，可知去离子水洗脱的TPS1、0.2 mol/L NaCl溶液洗脱的TPS2、0.3 mol/L NaCl溶液洗脱的TPS3比例较高。由表1可知，TPS1、TPS2和TPS3的回收率分别为5.85%、29.03%、34.67%。经纯化后，三种多糖级分蛋白质、多酚、还原糖含量都较低。TPS3糖醛酸含量最高，TPS2次之；TPS1中性糖含量较高，糖醛酸含量最低。这可能是因为洗脱溶液NaCl浓度越高，得到的金花茶多糖含有更多的硫酸基、羧基等，糖醛酸含量也更高。由表2可知，TPS1主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，是具有两种多糖混合的杂多糖，分子量分别为15.57×104、1.04×104 Da；TPS2、TPS3主要由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖组成，分子量分别为42.29×104、66.68×104 Da。由于TPS1是杂多糖且难以另外分离纯化，后续关于TPS1的实验皆采用混合多糖的形式进行，除分子量外不对单独组分作相关分析。
2 体外消化对金花茶多糖的影响
2.1 消化产物中金花茶多糖的分子量分析
由图2~图4可知，模拟口腔、模拟胃、模拟小肠消化前后，尽管峰形不完全相同，但出峰时间几乎没有变化。由表3可知，模拟口腔和模拟小肠消化前后，TPS1、TPS2和TPS3的相对分子质量均未产生变化；而模拟胃消化前后，混合杂多糖TPS1的两个多糖组分的分子量，以及TPS2和TPS3的分子量从15.57×104、1.04×104、42.29×104、66.68×104 Da变为15.09×104、0.92×104、41.33×104、65.26×104 Da。可知模拟胃液对金花茶多糖具有一定降解作用，但降解程度不高。研究表明，较低的pH可能会造成多糖的降解和断裂，这可能是模拟胃液致使多糖分子量降低的原因之一。
2.2 消化产物中还原糖含量分析
如表4所示，三种金花茶多糖级分在模拟口腔和模拟小肠消化前后，消化产物中还原糖含量基本没有变化。而经模拟胃消化前后，TPS1、TPS2和TPS3消化产物中还原糖含量由0.129±0.016、0.155±0.026、0.147±0.017 mmol/L增加为0.223±0.018、0.319±0.013、0.294±0.030 mmol/L。还原糖含量的增加说明金花茶多糖的部分糖苷键断裂，更多的还原末端暴露。可知模拟唾液、模拟肠液不能消化金花茶多糖，而胃液能够部分消化金花茶多糖，这与分子量测定结果一致。
2.3 消化结束后游离单糖含量分析
图5为单糖标准品的HPLC图谱，图6为添加了TPS1、TPS2和TPS3的体外消化组以及空白对照组在消化结束后的单糖释放情况。由空白对照组的HPLC图谱可知，模拟消化液中并没有碳水化合物。而三种金花茶多糖级分的HPLC色谱图中，只有溶剂峰，且与空白对照组出峰时间一致，且皆未检测出单糖组分。这与闵芳芳等关于青钱柳多糖的体外消化研究结果一致。
3 粪便酵解对金花茶多糖的影响
3.1 酵解过程中pH的变化
如图7所示，酵解期间（0~48 h），空白对照组的pH呈现先降低后略微升高的趋势。与空白对照组不同，添加了TPS1、TPS2和TPS3的酵解组的pH在酵解期间分别从7.54、7.56、7.50降低至5.84、5.72、5.66。TPS3酵解组的pH下降程度要略大于TPS2与TPS1。pH呈弱酸性与微生物代谢产生SCFAs有关。可知肠道菌群能够利用金花茶多糖，从而代谢产生大量SCFAs，使得酵解产物呈弱酸性。而TPS3相较TPS2与TPS1，促进SCFAs产生的作用更佳。
3.2 酵解过程中总糖和还原糖含量的变化
如图8、图9所示，酵解期间（0~48 h），添加了TPS1、TPS2和TPS3的酵解组总糖含量分别从0.85、0.83、0.89 mg/mL降低至0.073、0.091、0.049 mg/mL，总糖消耗率分别为91.4%、89.0%、94.5%；而还原糖含量在0~18 h期间分别从0.091、0.089、0.098 mg/mL增加至0.36、0.41、0.46 mg/mL，后在18~48 h期间降低0.051、0.084、0.040 mg/mL。总糖含量降低说明肠道菌群将金花茶多糖逐步分解吸收；还原糖含量前期增高可能是由于菌群降解多糖导致糖苷键被破坏，更多还原末端被释放出来；而后期这些短链还原糖又被菌群逐步分解利用，导致还原糖含量降低。
3.3 酵解过程中SCFAs含量的变化
表5为标准溶液中SCFAs的标准曲线。表6~表9分别为空白对照组及添加了TPS1、TPS2和TPS3的酵解液中SCFAs浓度变化。酵解期间（0~48 h），TPS1、TPS2和TPS3酵解液中乙酸浓度分别从2.26±0.11、2.22±0.21、2.31±0.39 mmol/L增加至18.01±0.67、24.11±0.84、29.28±1.37 mmol/L，是对照组的4.1、5.5、6.7倍；丙酸浓度分别从1.38±0.09、1.40±0.17、1.38±0.28 mmol/L增加到8.71±0.44、10.91±0.66、12.61±0.96 mmol/L，是对照组的3.7、4.7、5.4倍；丁酸浓度分别从0.69±0.04、0.71±0.10、0.71±0.09 mmol/L增加到2.63±0.20、3.70±0.88、4.83±0.86 mmol/L，是对照组的2.3、3.2、4.2倍。可知，TPS1、TPS2和TPS3均能促进肠道菌群分解并产生SCFAs，且乙酸含量增加最多；另外，TPS3相较TPS1和TPS2，能够更好地促使肠道菌群产生更多的SCFAs。
3.4 酵解过程中乳酸杆菌、双歧杆菌、
大肠杆菌的数量变化
表10~表13分别为空白对照组及添加了TPS1、TPS2和TPS3的酵解液中乳酸菌、双歧杆菌、大肠杆菌的菌落总数变化。酵解期间（0~48 h），TPS1、TPS2和TPS3组的乳酸菌数量分别增加了550、1513、2884倍；双歧杆菌数量分别增加了372、1348、1905倍；大肠杆菌数量分别减少为原来的72%、54%、32%。可知TPS1、TPS2和TPS3均可促使乳酸菌和双歧杆菌增殖，并抑制大肠杆菌生长。研究表明，多糖中的半乳糖醛酸能够促进乳酸菌、双歧杆菌等肠道有益菌群的繁殖，从而产生更多的SCFAs，尤其是乙酸；而SCFAs浓度的增加降低了肠道环境的pH，较低的pH能够在一定程度上抑制大肠杆菌等致病菌的生长。这可能是TPS3相较TPS2、TPS1，具有更好益生作用的原因之一。
3 结论
本文通过DEAE-52纤维素柱层析纯化金花茶多糖得到多糖级分TPS1、TPS2和TPS3。TPS1由两种多糖混合的杂多糖，分子量分别为15.57×104、1.04×104 Da，主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成；TPS2、TPS3均为均一多糖，分子量分别为42.29×104、66.68×104 Da，主要由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖组成。通过体外消化模型发现，TPS1、TPS2和TPS3在模拟口腔、模拟小肠期间，分子量未有明显改变；在模拟胃消化期间，分子量略微降低，有少量还原糖产生；整个消化过程未有游离单糖检出。通过体外酵解方法，发现TPS1、TPS2和TPS3在酵解期间（0~48 h），酵解液的pH、总糖含量均持续降低；还原糖含量在0~18 h期间升高，在18~48 h期间降低。酵解期间结束后，TPS1、TPS2和TPS3酵解液中乙酸浓度是空白对照组的4.1、5.5、6.7倍，丙酸浓度是空白对照组的3.7、4.7、5.4倍，丁酸浓度是空白对照组的2.3、3.2、4.2倍；TPS1、TPS2和TPS3组的乳酸菌数量分别增加了550、1513、2884倍；双歧杆菌的数量分别增加了372、1348、1905倍；大肠杆菌数量分别减少为原来的72%、54%、32%。综上所述，金花茶多糖在体外消化模型中不被消化，并能够被肠道微生物分解利用而产生短链脂肪酸，对乳酸菌、双歧杆菌的增殖有积极作用，对大肠杆菌的生长具有抑制作用，且TPS3相较TPS2、TPS1，具有更好的益生作用。
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