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南京农业大学大学芮昕副教授等主要探究乳酸菌对鹰嘴豆、豌豆、红芸豆、小扁豆这四种杂豆蛋白的凝胶形成、凝胶特性、微观结构、体外动态胃肠道消化中的消化行为的影响及蛋白凝胶对乳酸菌的保护作用，以期为植物基酸奶发酵底物的选择和发挥益生作用等方面提供理论依据。
1 四种杂豆蛋白提取物的主要成分分析
2 四种杂豆蛋白种类及浓度对发酵速率的影响
四种杂豆蛋白种类及浓度对发酵速率的影响如表 2 所示。发酵导致四种杂豆蛋白的 pH 均呈下降 趋势。由表 2 可知，下降速率随 pH 降低逐渐减缓。四种杂豆蛋白相比，蛋白浓度为 0.1%（w/v）的 RKP 和 PP 样品发酵速率更快；蛋白浓度为 1.0%~3.0% （w/v）的 LP 和 RKP 样品发酵速率更快，这说明低蛋 白浓度的 RKP 和 PP 和高浓度的 LP 和 RKP 发酵性能更优异。此外，高浓度蛋白（2.0%~3.0%，w/v）条 件下，pH 下降速率减缓，蛋白浓度在 3.0%（w/v）的 CP、RKP 和 PP 在 pH5.5 至 4.5 酸化速率变慢，而 3.0%（w/v）的 LP 酸化速率无明显变化。说明 LP 的 胶凝过程受蛋白浓度影响较小，而高浓度的 CP、 RKP 和 PP 可以显著延缓植物乳杆菌的产酸速率 （P<0.05），这可能与高浓度蛋白具有更强的缓冲作用有关。四种杂豆蛋白发酵速率的差异与乳酸菌差异化利用杂豆蛋白作为生长所需氮源密切相关。四种杂豆蛋白的组成、结构、小分子肽含量均可能导致乳酸菌代谢变化，从而影响产酸速率。郭增旺等发现球蛋白含量影响了芸豆蛋白的成胶速率。
3 最小临界凝胶浓度的测定
不同发酵时间及不同 pH 对四种杂豆蛋白成胶特性的影响如图 1 所示。CP、RKP、LP 和 PP 的最小临界凝胶浓度（LGC）分别为 1.6%（w/v）、1.6% （w/v）、1.4%（w/v）和 1.2%（w/v），说明 PP 可以在较低的蛋白浓度下形成凝胶，其次为 LP，而 CP 和 RKP 需要较高的浓度才可以形成凝胶。四种杂豆蛋白的 LGC 值均低于文献报道的乳酸菌诱导大豆蛋白形成凝胶的 LGC 值，说明四种杂豆蛋白具有良好的成胶特性。
四种杂豆 LGC 值的差异可能与各杂豆蛋白组成及蛋白结构差异密切相关。安馨等研究表明杂豆蛋白中球、清蛋白含量均占 80% 以上，但其比例各不相同，如芸豆、鹰嘴豆、小扁豆球蛋白含量较高，而清蛋白含量较低；豌豆蛋白中球蛋白含量较低 （56.6%±0.60%），清蛋白含量较高（34.0%±4.34%）。这可能是造成 PP 的 LGC 值较低的原因之一。此外，提高蛋白浓度促使杂豆蛋白在较高的 pH 条件下形成凝胶。当蛋白溶液浓度提升至 2.0%（w/v）时， CP 和 LP 初始凝胶 pH 由 4.5 上升至 5.0，RKP 和 PP 初始凝胶 pH 分别由 4.5和 5.0 上升至 5.5，这可能与四种杂豆蛋白中游离巯基等基团含量的差异有关， Yang 等研究指出 PP和 RKP 的游离巯基含量 高于 LP 和 CP 的游离巯基含量，且游离巯基含量可能与蛋白凝胶点呈正相关。
4 四种杂豆蛋白凝胶的质构特性分析
根据杂豆蛋白的最小凝胶浓度和发酵过程中 pH 下降规律，选取蛋白浓度在 2.0%（w/v），发酵终点 pH 为 5.0 的四种杂豆蛋白凝胶做进一步研究。
四种杂豆蛋白凝胶的质构特性如表 3 所示。由表 3 可知，杂豆蛋白种类对凝胶弹性和胶粘性的影响差异不显著（P>0.05）。CP 与 LP 蛋白凝胶的硬度显著高于 RKP 与 PP（P<0.05），且 LP 蛋白凝胶的硬度显著高于 CP（P<0.05），说明 CP 与 LP 的蛋白凝胶机械强度更高，特别是 LP 蛋白凝胶，而 RKP 与 PP 硬度较低。CP、PP 和 RKP 蛋白凝胶的内聚性显著高于 LP（P<0.05），说明 LP 蛋白凝胶内部结合力更小，这可能与四种杂豆蛋白组成差异有关。四种杂豆蛋白凝胶硬度和弹性值与文献报道的乳酸菌发酵大豆蛋白凝胶相比较低，说明杂豆蛋白形成的凝胶比较柔软，可能与 LGC 值较低有关。
5 四种杂豆蛋白发酵前后的色差分析
凝胶的色泽是影响其外观和认可度的重要指标 之一，其中 L *代表亮度，a *为红度值，b *为黄度值， ΔE 越大表示样品的颜色变化的程度越大。
四种杂豆蛋白发酵前后的色泽的变化如表 4 所 示。由表 4 可知，发酵后四种杂豆蛋白的 L *值均增 大，说明四种杂豆蛋白发酵后凝胶亮度增加，其中， LP 的亮度提升程度较高。这可能与凝胶的网络结构 增大了光反射的程度有关。有研究证明孔隙更 小的凝胶网络会导致反射光增强，因此亮度值更大。这与样品的微观结构相符。此外，CP、LP 和 PP 的 a *值均偏向绿色且 b *值均偏向黄色，而 RKP 的 a *值 偏向红色且 b *值偏向黄色。发酵没有改变四种杂豆 蛋白的 a *、b *值偏向，但改变了其偏向程度。发酵后 CP、LP 和 PP 蛋白的 a *、b *绝对值增大，而 RKP 的 a *、b *绝对值减小，说明发酵增加了 CP、LP 和 PP 的 黄绿程度且降低 RKP 的红黄程度。从总色差（ΔE） 的测定来看，发酵后四种杂豆蛋白凝胶样品的总色差 均减小且总色差仍差异显著（P<0.05），其中，CP 和 LP 样品降幅明显小于 RKP 和 PP，说明 LP 和 CP 颜 色变化程度更浅。这与计红芳等研究报道豌豆蛋 白与牛肉盐溶蛋白共混形成凝胶后样品亮度增大以 及红度和黄度偏向加深相符。
6 四种杂豆蛋白凝胶的微观结构分析
微观结构的表征是研究凝胶结构与特性的重要手段。四种杂豆蛋白凝胶的微观结构如图 2 所示。由图 2 可知，所有杂豆蛋白凝胶样品的微观结构都 呈现网状多孔结构，且不同杂豆蛋白凝胶网络结构存在一定差异。RKP 和 PP 样品均具有带非均质孔和大量粗链的凝胶结构，其孔径约为 20 μm。而 CP 和 LP 呈现出密集和精细的蛋白三维凝胶网络，其孔 径约为 2.5 μm。与 LP 相比，CP 的三维凝胶网络含有大量粗链且网孔分布不均匀，LP 形成一种无粗链结构、孔洞均匀的三维凝胶网络。聂丽洁曾指出球蛋白含量更高的 CP 和 LP 蛋白凝胶结构更致密。Xing 等研究报道乳酸菌发酵的大豆生物豆腐中呈现类似的蜂窝状凝胶网络结构。
7 杂豆蛋白凝胶对动态胃肠道消化的 pH 影响分析
四种杂豆蛋白凝胶对胃肠道消化 pH 的影响如图 3 所示。杂豆蛋白凝胶中蛋白质等物质具有一定的缓冲作用。蛋白质结构的改变可能引起酶解特性的变化。由图 3 可知，肠道消化的初始 pH 为 7.0，在肠消化前期（0~30 min），LP 的肠消化液的 pH 最高，PP 的肠消化液 pH 最低，各样品间均存在 显著差异（P<0.05），这可能与其胃肠转换速率及碱性 氨基酸的释放有关。在肠消化中期和后期（30~ 180 min），RKP 与 PP 蛋白的肠消化液 pH 变化比 CP 与 LP 更剧烈，说明 CP 与 LP 蛋白对胃肠液的缓冲 能力高于 RKP 与 PP 蛋白，这可能与致密的凝胶网 络更耐受胃肠液的环境有关。有研究表明杂豆蛋 白中球蛋白在胃肠消化过程中缓冲能力高于清蛋白， 这可能是球蛋白含量高的 CP 和 LP 蛋白凝胶样品 具有更强的缓冲能力的原因。
8 杂豆蛋白凝胶在胃肠道消化过程中可溶性蛋白含 量的变化
四种杂豆蛋白凝胶在肠消化中可溶性蛋白的含量如图 4 所示。可溶性蛋白含量表征容易发生酶水 解的蛋白质数量指标。由图 4 可知，四种蛋白凝 胶经动态胃肠消化后可溶性蛋白含量均呈现先上升后下降的趋势。在消化早期（0~30 min），各组杂豆凝胶可溶性蛋白呈上升趋势且于肠消化 30 min 达到顶点，表明可溶性蛋白在消化早期呈现释放过程。其中， LP 消化产物可溶性蛋白含量最高，其次为 CP 和 RKP， 而 PP 可溶性蛋白显著较低（P<0.05）。这一研究结果说明 LP、CP 与 RKP 凝胶在肠道蠕动、pH 作用与消化酶解作用下更易释放可溶性蛋白。在消化中期和后期（30~180 min），各组样品可溶性蛋白含量下降，这可能是由于排空或蛋白降解为小分子肽所致，CP 和 LP 蛋白凝胶的可溶性蛋白含量减少量显著低于 RKP 和 PP 蛋白凝胶（P<0.05），可能与其较为致密的凝胶结构有关。Yang 等研究指出致密的凝胶网络会延缓胃消化过程的蛋白质水解速率。
9 杂豆蛋白凝胶在胃肠道消化过程中肽含量的变化
四种杂豆蛋白凝胶在肠消化时间（0、30、90、 120 min）的消化产物中肽的含量变化如图 5 所示。由图 5 可知，在肠消化早期（0~30 min），CP 与 LP 蛋白凝胶释放的肽含量明显高于 RKP 与 PP 蛋白凝胶 且 CP 与 LP 蛋白凝胶的肽含量均为 RKP 和 PP 蛋白凝胶的两倍左右，说明 CP 和 LP 凝胶酶解速率较快，这可能与蛋白酶对 CP 和 LP 蛋白水解作用更强和可溶性蛋白底物量更高有关；在消化中期和后期 （30~180 min），尽管 RKP 和 PP 消化产物的肽含量得到了一定程度的提升，但 CP 和 LP 的肽含量仍显 著高于 RKP 和 PP（P<0.05），且 CP 与 LP 之间的肽含量仍存在显著差异（P<0.05），这说明不同杂豆在乳酸菌作用下形成的凝胶及结构差异可能蛋白酶切位点暴露的差异，从而影响其消化效率。结果表明，结构较为致密的凝胶（CP 和 LP）释放肽的能力优于结构较为疏松的凝胶（RKP 和 PP）。四种杂豆蛋白凝胶肽含量变化趋势与大豆蛋白凝胶的体外消化特性相似，研究表明，乳酸菌诱导的大豆蛋白凝胶网络结 构对蛋白质消化及释放肽有一定的延缓作用。这与本研究结果相似。
10 杂豆蛋白凝胶在动态胃肠消化中对植物乳杆菌 B1-6 活力的保护作用研究
乳酸菌通常以口服的形式进入人体，所以只有耐受胃及十二指肠道的严苛环境，到达小肠才能发挥生理功效。因此，对植物乳酸杆菌在不同杂豆蛋白凝胶结构内的耐受胃肠消化的程度进行了比较研究。
四种杂豆蛋白凝胶在胃肠道中消化对植物乳杆菌 B1-6 活菌数的影响如图 6 所示。由图 6 可知，经动态胃肠消化后，四种杂豆蛋白凝胶中植物乳杆菌的存活率均呈下降趋势。在消化前期与中期（0~90 min）， CP、LP 与 PP 样品的植物乳酸杆菌存活率显著高于 RKP（P<0.05）。在消化后期（90~180 min），所有杂豆蛋白的植物乳杆菌存活率均下降至最低且四组凝胶不存在显著差异（P>0.05）。结果表明，消化前期和中期致密的凝胶网络结构对植物乳杆菌的保护作用更佳，凝胶结构在消化后期的解构导致植物乳杆菌的保 护作用的大幅削弱。这与伍鹏等报道发酵乳中酪蛋白在胃肠道消化环境中形成结构致密的凝聚物对乳酸菌有保护作用类似。李军等曾报道肠道消化阶段末期动物双歧杆菌活菌数大量下降，这与本研究结果一致。
结论
本文对植物乳杆菌引导四种杂豆（鹰嘴豆、红芸 豆、小扁豆、豌豆）蛋白凝胶形成及特性进行了研究， 结果表明：鹰嘴豆蛋白、红芸豆蛋白、小扁豆蛋白和豌豆蛋白的最小临界凝胶浓度（LGC）分别为 1.6% （w/v）、1.6%（w/v）、1.4%（w/v）和 1.2%（w/v）；质构特性结果表明 CP 和 LP 蛋白凝胶硬度显著高于 RKP 和 PP 蛋白凝胶（P<0.05），微观结构结果表明 CP 和 LP 形成的凝胶具有较为致密而均匀的三维蛋白凝胶网络，而 RKP 与 PP 形成的凝胶微观结构较 为疏松。采用动态模拟胃肠道消化模型对具有不同结构特征的四种杂豆蛋白凝胶进行消化特性评估，结果表明，CP、LP 蛋白在消化早、中期的可溶性蛋白和肽含量显著高于另两组蛋白凝胶（RKP 和 PP），且 CP、LP 蛋白凝胶对植物乳杆菌 B1-6 的保护作用显著优于另两组蛋白凝胶。本研究结果有助于加深对四种杂豆蛋白在乳酸菌发酵作用下表现出差异性胶凝能力及消化特性的影响认知，为明确不同杂豆蛋白在乳酸菌作用下的发酵性能、凝胶特性及营养特性提供了理论与应用基础。
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