图片来源于图司机
南昌大学食品学院陈军副院长等本文拟采用两种动物蛋白——乳铁蛋白、β-乳球蛋白和两种植物蛋白——大米蛋白、大豆分离蛋白为原料。探究它们对甜菜昔热稳定性的影响。采用浊度、紫外光谱、粒径等方法表征蛋白-甜菜复合物的形成，并研究四种蛋白质与甜菜昔的相互作用机制，最后，采用分子对接的手段将蛋白质与甜菜昔的相互作用可视化。本研究为甜菜昔稳定性研究提供了更多的思路，拓宽了提高甜菜昔稳定性的可用蛋白质资源范围。
如图 1 所示，甜菜苷水溶液在 80 ℃ 下加热 60 min 后大幅度降解，甜菜苷保留率仅为 6.26%，而添加乳铁蛋白后，甜菜苷保留率随乳铁蛋白比例的增大而提高至 20.48%、27.01% 和 23.81%，较大程度地提高了甜菜苷的热稳定性，添加 β-乳球蛋白后，甜菜苷保留率随着 β-乳球蛋白比例的增加分别提高至 8.49%、7.25% 和 13.86%。大米蛋白的加入使甜菜苷保留率提高至 9.94%、12.80% 和 12.59%。大豆分离蛋白的加入使甜菜苷保留率提高至 10.87%、13.19% 和16.04%。以上结果表明，动物蛋白乳铁蛋白、β-乳球蛋白和植物蛋白大米蛋白、大豆分离蛋白对甜菜苷的热稳定性均有一定程度的提高，且热稳定性的提高效果乳铁蛋白>大豆分离蛋白>β-乳球蛋白≈大米蛋 白。蛋白质对甜菜苷热稳定性的提高可能与蛋白-甜菜苷复合物的形成有关。值得注意的是，甜菜苷热稳定性随着 β-乳球蛋白、大豆分离蛋白比例的增加而升高，但随着乳铁蛋白和大米蛋白比例的增加而先升高后降低，这可能是因为在一定范围内，蛋白质与甜菜苷发生了非共价相互作用形成了复合物，在一定范围内，蛋白质的比例越高，与甜菜苷复合的蛋白质越多，提高了甜菜苷的热稳定性。此外，尽管乳铁蛋白和 β-乳球蛋白都是乳清分离蛋白的主要组成成分，但乳铁蛋白对甜菜苷热稳定性的提高效果与乳清分离蛋白的效果十分接近，而 β-乳球蛋白的效果则相对微弱，这一结果表明，在乳清分离蛋白中，对甜菜苷起热保护作用的主要物质可能是乳铁蛋白。
胶体体系是一种高度分散的介稳体系，电荷斥力和布朗运动使得胶体粒子能够抵御重力沉降，始终保持悬浮状态。胶体体系的浊度取决于胶体粒子的数量、大小和折射率。胶体复合物的粒径越大，数量越多，其光透过率则越小，其浊度也越大。因此，胶体复合物的形成可通过样品的浊度变化初步证明。图 2 显示了不同甜菜苷比例的添加对乳铁蛋白、β- 乳球蛋白、大米蛋白、大豆分离蛋白浊度与外观的影响。当将蛋白质与甜菜苷的比例从 8:0 增加到 8:4 时，蛋白质的浊度随着甜菜苷比例的增加而显著增加（P<0.05），从外观上可以观察到溶液变得越来越浑浊，且静置 24 h 后未出现沉淀和聚集现象，这些结果表明蛋白质乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大米蛋白、大豆分离蛋白与甜菜苷形成了稳定的胶体复合物，具有较强的抗重力作用。
蛋白质分子中芳香氨基酸残基微环境的变化可能会改变蛋白质的紫外吸收。蛋白质的紫外吸收随着配体小分子的加入而增强可作为判断二者是否结合的有力依据。如图 3 所示，乳铁蛋白和 β-乳球蛋白在 280 nm 处有最大吸收峰，大米蛋白和大豆分离蛋白在 260 nm 处有最大吸收峰。260~280 nm 处的吸收峰主要源于蛋白质色氨酸和酪氨酸的吸 收，随着甜菜苷比例的增加，蛋白质的紫外吸收逐渐增强，表明蛋白质的氨基酸残基微环境发生了改变，蛋白质与甜菜苷之间结合形成了复合物。类似的现象也发生在大豆分离蛋白与原花青素的相互作用中，与原花青素结合后，大豆分离蛋白的紫外吸收显著增强。从四种蛋白质紫外光谱的变化可看出，蛋白质紫外吸收增强的程度和其对甜菜苷的热保护效果呈现正相关，这意味着蛋白质对甜菜苷的热保护效果与甜菜苷-蛋白结合程度有关。
蛋白质与配体小分子发生相互作用后常常形成聚集的复合物，导致粒径增大。Dai 等研究了大豆分离蛋白与儿茶素的相互作用，发现大豆分离蛋白- 儿茶素复合物的粒径随着儿茶素浓度的增大而增大。图 4 显示了 4 种蛋白质与甜菜苷复合物的 PDI（多分散系数）和平均粒径的变化，PDI 用于描述样品粒径分布，PDI 越小，说明样品尺寸越均一，PDI 越大，粒径分布越宽，指示着样品发生了聚集现象。四种蛋白质的 PDI 值始终低于 0.7，说明粒径的数据准确可靠。乳铁蛋白的初始粒径为 37.71 nm，当与甜菜苷复合后，复合物的粒径逐渐增加，并在乳铁蛋白：甜菜苷=8:2 时达到最高值 55.44 nm，其 PDI 值略有升高，但无显著性变化（P>0.05）。β-乳球蛋白的粒径为 1957 nm，随着甜菜苷比例的增加，β-乳球蛋白-甜菜苷复合物的粒径呈现先增加后减小的趋势，在 β- 乳球蛋白:甜菜苷=8:3 时达到最大值 3184 nm，PDI 的逐步增加表明复合物随着甜菜苷比例的增加逐渐发生聚集。大豆分离蛋白的粒径为 80.83 nm，在大豆分离蛋白：甜菜苷=8:3 时达到最大值 342.9 nm， 其 PDI 值逐渐升高意味着甜菜苷的加入促进了蛋白质的聚集。不同的是，当甜菜苷的比例逐渐增加时，大米蛋白-甜菜苷复合物的粒径和 PDI 值皆无显著性变化（P>0.05）。以上结果表明，乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大豆分离蛋白与甜菜苷复合后引起了蛋白质的聚集，导致了粒径的增大。而大米蛋白-甜菜苷的粒径随着甜菜苷含量的增加并无显著性差别（P> 0.05），这可能说明大米蛋白与甜菜苷之间没有形成聚集性复合物，或是大米蛋白与甜菜苷之间的相互作用过弱而无法引起聚集。这个现象与紫外光谱的结果吻合，甜菜苷与乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大豆分离蛋白的结合比与大米蛋白的结合更加紧密。
甜菜苷是一种水溶性色素，更加亲水的环境能够容纳更多的甜菜苷。因此，蛋白质的表面结构或许与它们的相互作用有关。乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大米蛋白、大豆分离蛋白四种蛋白质的表面形态如 图 5 所示，通过扫描电子显微镜在 200 倍放大的条件下观察，可以观察到乳铁蛋白、大米蛋白、大豆分离蛋白是不规则形状的蛋白质，而 β-乳球蛋白是典型的球型蛋白。从结构上而言，乳铁蛋白、大米蛋白和大豆分离蛋白均具有褶皱型的粗糙表面，可能有更多与小分子相互作用的位点，有利于它们与甜菜苷发生相互作用。从溶解性方面，乳铁蛋白、β-乳球蛋白是高溶解度的动物蛋白，大豆分离蛋白是一种溶解性较高的植物蛋白，然而大米蛋白因具有高度的表面疏水性而难以溶解，因此可能与甜菜苷结合的蛋白含量较少，且较低的表面亲水性也导致了其缺乏足够的甜菜苷结合位点。这可能是大米蛋白与甜菜苷的结合能力远小于其他三类蛋白的原因。
为了探明乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大米蛋白、大豆分离蛋白分别与甜菜苷结合的相互作用机制，本文采用了添加干扰剂并测定浊度的方法表征蛋白质与甜菜苷之间存在的相互作用力。前文浊度的实验结果已经说明，蛋白质与甜菜苷形成了胶体复合物，这主要依靠二者间的非共价相互作用。因此，假定蛋白质与甜菜苷之间存在着氢键、疏水相互作用和静电相互作用等非共价相互作用，若添加干扰剂后浊度下降，则表明复合物中相应的作用力被破坏，复合物无法形成，进而从逆向角度表征蛋白质与甜菜苷的主要相互作用力。尿素（Urea）是一种很强的氢键受体，能有效破坏分子间的氢键作用力。十二烷基硫酸钠（SDS）是一种破坏疏水相互作用的两亲性分子。而氯化钠（NaCl）是一种可电离的盐，可改变水分子在物质中的结合形式以此来增强疏水相互作用，屏蔽静电相互作用。由图 6A可看出，乳铁蛋白-甜菜苷复合物的浊度随着干扰剂的添加而降低，且尿素和氯化钠的干扰效果最强，该结果表明，在乳铁蛋白-甜菜苷复合物中存在着氢键、疏水作用力和静电相互作用，而氢键和静电相互作用占主导地位；图6B显示了干扰剂对β-乳球蛋白-甜菜苷复合物的影响，结果表明，氢键是 β-乳球蛋白与甜菜苷结合的主要作用力；在图 6C 中，疏水作用力是大米蛋白-甜菜苷复合物的主要相互作用力；图 6D 显示了三种干扰剂对大豆分离蛋白-甜菜苷复合物浊度的影响，结果表明，尿素和氯化钠使得复合物的浊度略有下降，表明在大豆分离蛋白-甜菜苷复合物中存在氢键和静电相互作用。
将乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大米蛋白、大豆分离蛋白四种蛋白质分别与甜菜苷进行分子对接模拟，以确认蛋白质与甜菜苷的结合位点，结果如图 7 所示。图 7A 为乳铁蛋白与甜菜苷的分子对接结果，乳铁蛋白中的 HIS A:253、SER A:185、PRO A:188、GLU A:187 与甜菜苷之间发生氢键相互作用，键长分别为 2.58、2.52、2.41、2.62 Å，而氨基酸 ASP A:297（5.10 Å）、GLU A:15（5.44 Å）、LYS A:197（4.35 Å）与甜菜苷主要依靠静电相互作用结合。图 7B 展示了 β-乳球蛋白与甜菜苷的分子对接结果，β-乳球蛋白的氨基酸 GLN A:120（2.68 Å）和 PRO A:38（2.60 Å）是其与甜菜苷发生氢键相互作用的位点， PHE A:105（4.74 Å）与甜菜苷通过静电相互作用结合。在图 7C 中，大米蛋白的氨基酸 MET 394 与甜菜苷之间通过疏水相互作用结合，键长为 4.28 Å。从图 7D 中可以看出，大豆分离蛋白的氨基酸 SER A:331（4.36 Å）、SER A:383（3.73 Å）、THR A:384（4.65 Å）、TYR A:313（4.00 Å）、GLY A:332（3.97 Å）与甜菜苷之间主要通过氢键发生相互作用，而 ASP A:334（4.18 Å）、ARG A:188（8.30 Å）主要通过静电相互作用与甜菜苷结合。这些结果与前文所述相互作用的结果基本一致。
食品科学家论文汇总
（点击专家姓名，查看论文）
《食品工业科技》特邀主编专栏征稿
《食品工业科技》青年编委专栏征稿：AI for Food Industry:人工智能在食品工业中的应用 ☚
《食品工业科技》青年编委专栏征稿：组学分析技术在食品品质研究中的应用 ☚
群聊：食品工业科技作者群
温
馨
提
示
我刊正式组建微信作者群，为作者提供更多的学术与论文资讯，如需进群，请联系刘老师（微信：上方二维码,电话：87244117-8062）。
版权声明
