文章鉴读|浙江工业大学食品科学与工程学院邵平教授团队：铁皮石斛多糖的低共熔溶剂提取工艺优化

食品工业科技编辑部

2025-01-16

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摘要

为提高铁皮石斛的综合利用率，建立一种绿色高效的铁皮石斛多糖提取方法。本研究以铁皮石斛多糖提取率为指标，通过单因素考察了低共熔溶剂浓度、提取温度及液料比对铁皮石斛多糖提取率的影响，采用响应面设计优化铁皮石斛多糖的提取工艺，并对纯化后的多糖进行结构分析。结果表明：响应面优化后得到最佳工艺为低共熔溶剂（deep eutectic solvent，DES）浓度40%、提取温度80 ℃、液料比110:1（mL/g），在此条件下实际提取率为33.2%±0.28%，与预测值33.5%接近，多糖的纯度为56.95%±1.2%。多糖经阴离子交换柱及葡聚糖凝胶柱纯化后，纯度可达90.8%，其单糖主要由葡萄糖和甘露糖构成，质量比约为43:37，此外还含有少量的木糖、鼠李糖、核糖等，结构中同时含有α糖苷键和β糖苷键。本研究提供了一种低共熔溶剂提取铁皮石斛多糖的高效绿色提取方案，具有多糖提取率高及绿色的特点，为后续铁皮石斛多糖的开发提供了借鉴。

Abstract

In order to increase the comprehensive utilization of Dendrobium officinale, a green and efficient method for extracting of Dendrobium officinale polysaccharides (DOPs) was established. This research used the extraction rate of DOPs as the indicator for the effects of three factors. These included the concentration of deep eutectic solvent (DES), extraction temperature, and liquid-to-material ratio on the efficacy of polysaccharides from Dendrobium officinale, using single-factor tests. Response surface methodology (RSM) was employed to optimize the best extraction process of DOPs and the structure of the purified polysaccharides was analyzed. The experimental results showed that the optimal process obtained after RSM was a 40% concentration of DES, an extraction temperature of 80 ℃, and a liquid-to-material ratio of 110:1 (mL/g). Under these conditions, the actual extraction rate was 33.2%±0.28%, which was close to the predicted value of 33.5%, and the purity of polysaccharide was 56.95%±1.2%. After purification by anion-exchange column and glucose gel column, the purity could reach 90.8%, and its monosaccharides were mainly composed of glucose and mannose, with a mass ratio of 43:37. It also contained a small amount of xylose, rhamnose, and ribose, and the structure contained α-glycosidic and β-glycosidic bonds. The present research provides an efficient and green extraction scheme for extracting DOPS with DES, which has the characteristics of high polysaccharide extraction rate and greenness, providing a reference for the subsequent development of DOPs.

铁皮石斛是兰科属草本植物，被称为“九大仙草之首”，含有多种活性物质，如多糖、氨基酸类和生物碱等。其中，铁皮石斛多糖是铁皮石斛的主要功能活性成分，具有抗氧化、抗衰老、免疫调节、抗肿瘤和降血糖等作用。因此，建立高效、绿色的铁皮石斛多糖提取工艺有利于铁皮石斛的药食两用价值的开发。邱现创等通过超声辅助法提取铁皮石斛多糖，提取率可达25.39%。廖霞等利用微波辅助结合酶解提取法，铁皮石斛多糖提取率可达29.40%。李贝贝等研究了闪式提取法提取铁皮石斛多糖，在最佳优化工艺条件下浸泡30 min后，常温下提取3次，提取率达到31.45%。Kui等从石斛中提取出了3种水溶性多糖，其主要由甘露糖和葡萄糖以不同的比例组成。高云霄等用热水浸提法从铁皮石斛中提取得到一种以1,4-链接为主，存在少量1,2,4-、1,3,4-、1,4,6-分支结构和端基结构的O-乙酰化葡甘露聚糖。铁皮石斛多糖的结构是其呈现生物活性的基础，选择不同的提取、纯化分离方法，所得到的多糖在单糖组成及多糖结构上会有显著不同，而这往往会直接影响多糖的生物活性。

低共熔溶剂（deep eutectic solvent，DES）由氢键受体和氢键供体混合而成。DES已被证明是一种新型绿色溶剂，具有成本低、易合成、无毒和可生物降解等优异性能。其现已被用于功能成分的提取，如提取槲皮素、提取甜菜碱及提取姜黄素，目前，已有部分研究将DES的绿色提取工艺用于铁皮石斛总黄酮的提取，但其在铁皮石斛多糖的提取中应用较少。

DES具有安全性高、价格低廉及绿色等特点，课题组前期对近40种不同比例和原料的DES进行了筛选，发现基于氯化胆碱及乳酸的DES产生的氢键数最多。因此，本研究选择氯化胆碱与乳酸作为制作DES的原料，利用响应面法优化铁皮石斛多糖的提取工艺。在铁皮石斛多糖提取后，进一步研究其单糖组成及可能的分子结构，以期为铁皮石斛多糖的高效提取提供理论依据。

结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 DES浓度对铁皮石斛多糖提取率的影响

DES浓度的变化对铁皮石斛多糖提取率的影响如图1所示。由图1可知，铁皮石斛多糖的提取率呈先上升后逐渐下降的趋势，当DES的浓度从20%升到40%时多糖提取率从15.1%升到30.7%，原因可能是随着DES浓度的提高，DES中氢键受体和配体的数量逐渐增加，导致氢键数目会增加，让更多的多糖渗入到提取液中，从而提高了多糖提取率。当DES浓度继续提高，多糖的提取率逐渐下降，这是因为DES试剂是由氯化胆碱和乳酸配制而成，试剂内部离子力通常较强且黏度较大，不利于溶质的溶出，因此在使用过程中加入适量的蒸馏水来降低溶液的剪切力。因此在40%DES浓度时更有利于铁皮石斛多糖的提取，并选取DES浓度为30%、40%、50%做响应面试验以确定最佳DES浓度。

图 1 DES浓度对铁皮石斛多糖提取率的影响

Figure 1. Effect of DES concentration on the extraction rate of Dendrobium officinale polysaccharides

注：不同字母表示差异显著（P<0.05），图2、图3同。

2.1.2 温度对铁皮石斛多糖提取率的影响

温度变化对铁皮石斛多糖提取率的影响如图2所示。由图2可知，铁皮石斛多糖的提取率变化呈缓慢上升后下降的趋势，当温度从50 ℃升高到80 ℃时，多糖提取率最高，从14.2%升高到23.4%，是因为随着温度的升高，增加了物质的热运动，提高了多糖分子扩散效率，使多糖在整个体系中的溶解更迅速。当温度继续提升到90 ℃，多糖的提取率反而略有下降。一方面，可能是因温度继续升高时，铁皮石斛多糖中可能存在热敏性物质，在温度升高条件下会使得这些成分易变性降解，另一方面，较高温度导致蒸发，影响了溶剂平衡，从而降低了提取率。因此，选取提取温度为70、80、90 ℃做响应面试验以确定最佳提取温度。

图 2 温度对铁皮石斛多糖提取率的影响

Figure 2. Effect of temperature on the extraction rate of Dendrobium officinale polysaccharides

2.1.3 液料比对铁皮石斛多糖提取率的影响

液料比对铁皮石斛多糖提取率的影响如图3所示，铁皮石斛多糖的提取率变化呈现先上升后下降的趋势，当液料比为110:1时提取率最高，从18.1%升高到32.2%，可能是由于DES为黏稠液体，在一定范围内，随着液料比提高，溶剂与铁皮石斛的接触面积增多，增加了多糖的溶出，使得多糖提取率增加；但溶剂加入过多时，溶剂用量较大，铁皮石斛粉与溶剂接触面积不断增大，溶出了其他杂质，导致多糖溶解被抑制。因此，选取90:1、110:1、130:1（mL/g）做响应面试验以确定最佳液料比。采用DES不仅对铁皮石斛多糖实现了绿色提取，同时在提取率上也优于超声辅助、微波辅助结合酶解及闪式提取。

图 3 液料比对铁皮石斛多糖提取率的影响

Figure 3. Effect of liquid-to-material ratio on the extraction rate of Dendrobium officinale polysaccharides

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验设计与结果

在铁皮石斛多糖提取的过程中，以DES浓度、提取温度和液料比为影响因素，多糖提取率为响应值。试验设计与结果见表2。

2.2.2 响应面二次回归模型的建立与方差分析

由表2的试验结果，用响应面分析软件操作，得出铁皮石斛多糖提取率为响应值 Y的回归方程：Y=33.55+1.56A+0.36B+0.75C−0.42AB+0.14AC+0.13BC−6.29A²−6.75B²−5.92C²。由表3方差分析结果可知，该模型的F=681.25，回归模型项 P<0.0001，失拟项P>0.05，为不显著，说明试验误差小。试验结果与模型拟合度好。由F检验可知，影响铁皮石斛多糖提取率的主次因素为DES浓度>液料比>提取温度，方差分析显示，A、C 对 Y影响极显著（P<0.001），B对 Y影响显著（P<0.05），A²、B²、C²都是极显著的模型项（P<0.001）。

2.2.3 响应面曲面分析因素之间的交互作用

用Design-Expert 8.6 软件，对DES浓度、提取温度、液料比3个因素两两交互，做不同因素间响应面3D图，响应面图和等高线图可以反映各因素间的相互作用及最佳参数。三维图越陡峭，表明相应因素对多糖提取率影响较大。图4B等高线图为近圆形可知液料比和DES浓度的交互作用对响应值的影响不显著；由图4C可知，铁皮石斛多糖的提取率随液料比及提取温度的增加呈先上升后下降的趋势，等高线图为近圆形说明对铁皮石斛多糖提取率无显著影响。由图4知，两因素交互项AB>AC>BC，其中仅有AB的P<0.05，表明AB两因素间交互作用对响应值的影响显著，随着提取温度的升高，分子运动加快，提高了溶剂的渗透能力，提取率随之升高，但温度过高可能会对多糖分子结构产生破坏作用。

图 4 各因素交互作用对铁皮石斛多糖提取率的影响

Figure 4. Effect of interaction of various factors on the extraction rate of Dendrobium officinale polysaccharides

2.2.4 响应面优化与验证实验

利由响应面软件分析显示预测最佳提取工艺条件为DES浓度39.5%、提取温度80.1 ℃、液料比112.4:1（mL/g），铁皮石斛多糖提取率为33.5%。根据实际情况调整提取参数为DES浓度40%、提取温度 80 ℃、液料比110:1（mL/g），在此条件下提取2 h，得出验证结果多糖提取率为 33.2%±0.28%，拟合度好，误差为1.7%，充分验证了模型的准确性，该工艺优化合理、有效。多糖的纯度为56.95%±1.2%。与传统的提取方法相比较，本文采用DES溶剂提取铁皮石斛多糖实现了较高的提取率，陈盛余等采用微波辅助提取铁皮石斛多糖，其提取率为9.77%，而王琳等采用热水浸提法提取铁皮石斛多糖，其提取率为30.83%，均较DES溶剂提取率低，此外本研究提取方法绿色、安全性高，可以为后续的提取提供一种高效绿色的方案。

2.3 阴离子交换柱纯化

如图5所示，DOP纯化后得到3个多糖洗脱组分，DOP1为蒸馏水洗脱得到的组分；DOP-2为0.05 mol/L NaCl溶液洗脱下的组分；DOP-3为0.1 mol/L NaCl溶液洗脱下的组分。由洗脱图谱可见三个组分均未出现拖尾现象，表明各组分间分离效果较好，与DOP-2和DOP-3相比较，DOP-1组分相对含量高，占比为72.6%。洗脱过程在260和280 nm波长处未出现特征性吸收峰，这表明其不包含游离的蛋白质和核苷酸，达到初步纯化的效果。

图 5 铁皮石斛粗多糖阴离子交换柱洗脱曲线

Figure 5. Anion exchange column elution curve of crude Dendrobium officinale polysaccharides

2.4 葡聚糖凝胶柱纯化

继续采用Sephadex G-100色谱柱对DOP-1进一步纯化，结果如图6所示。DOP-1获得一个集中的单峰，表明其纯度较高。收集8~30管DOP-1的洗脱液并进行冷冻干燥得到纯化多糖，测定其纯度为 90.8%，命名其为DOP-1-1。

图 6 铁皮石斛多糖的葡聚糖凝胶柱洗脱曲线

Figure 6. Dextran gel column elution profile of Dendrobium officinale polysaccharides

2.5 铁皮石斛的单糖组成分析

采用GC-MS对DOP-1-1进行单糖组成分析，多糖的总离子流色谱图如图7所示。通过对比标准单糖（图7A）可知，铁皮石斛多糖组分主要由葡萄糖和甘露糖单糖组成，根据峰面积计算葡萄糖和甘露糖的总和占比80%，葡萄糖和甘露糖质量比约为43:37，此外还含有少量的木糖、鼠李糖、核糖等。表明DOP-1-1是一种葡甘露聚糖为主的杂多糖。

图 7 单糖标准品（A）和铁皮石斛多糖（B）GC-MS总离子流色谱图

Figure 7. GC-MS total ion flow chromatogram of monosaccharide standard (A) and Dendrobium officinale polysaccharides (B)

注：1.鼠李糖；2.阿拉伯糖；3.甘露糖；4.葡萄糖；5.半乳糖；6.核糖；7.木糖。

2.6 铁皮石斛多糖的核磁共振分析

铁皮石斛多糖的¹H NMR（图8A）显示9个异头氢，其化学位移δ分别为1.85、2.13、3.29、3.50、3.76、4.07、4.70、5.35、5.45；¹³C NMR谱图（图8B）显示有7个信号峰，其化学位移δ分别为20.28、60.42、69.99、71.54、75.00、76.53、100.16。在4.070~4.741 ppm与4.036~4.703 ppm处的强烈异头质子信号峰是由D₂O中的HDO所引起的。¹H NMR光谱中δ3.76 ppm和¹³C NMR光谱中δ71.54 ppm处的强烈信号提示其可能含有（1→3）糖苷键的连接方式。¹H NMR光谱中δ3.29 ppm和¹³C NMR光谱中δ69.99 ppm处的强烈信号提示多糖中存在（1→4）糖苷键。在δ3.50 ppm处的信号峰提示提示可能存在（1→2，4）糖苷键。¹H NMR光谱中δ5.45 ppm的化学位移来自1，3-Galp的H₁。此外¹H NMR一般用于研究多糖糖苷键的结构特点，α糖苷键的质子信号通常集中在大于5 ppm的位置，而β糖苷键的化学位移一般低于5 ppm，表明其同时含有α糖苷键和β糖苷键。

图 8 铁皮石斛多糖的核磁共振图谱

Figure 8. Nuclear magnetic resonance mapping of Dendrobium officinale polysaccharides

结论

本文通过DES溶剂提取铁皮石斛多糖的结果表明，响应面试验得到最佳提取工艺为DES浓度40%、提取温度 80 ℃、液料比110:1（mL/g），此条件下铁皮石斛多糖提取率达 33.2%±0.28%，多糖的纯度为56.95%±1.2%。在纤维素柱与凝胶柱纯化后，多糖的纯度可达90.8%，多糖组分主要由葡萄糖和甘露糖构成，其质量比约为43:37，还含有少量的木糖、鼠李糖、核糖等，结构中同时含有α糖苷键和β糖苷键，采用DES法提取多糖，可以有效提高多糖提取率。本研究建立了一套绿色、高效的铁皮石斛多糖提取方法，为后续的铁皮石斛多糖开发提供参考。

引用本文：冯思敏，廖伟先，潘杰峰，等. 铁皮石斛多糖的低共熔溶剂提取工艺优化[J]. 食品工业科技，2024，45（3）：218−225. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2023050089.

Citation:FENG Simin, LIAO Weixian, PAN Jiefeng, et al. Optimization of Deep Eutectic Solvent Extraction Process of Polysaccharides from Dendrobium officinale[J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(3): 218−225. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2023050089.

基金项目:国家食品营养与安全重点研发计划专项（2023YFF1104100）；浙江省重点研究发展计划项目（2021C02019）；浙江省自然科学基金项目（LGD22C200001）。

通信作者简介

邵平，工学博士，教授，博士生导师，1998-2007年合肥工业大学，2007年博士毕业后入职浙江工业大学，2009年评为副教授，2015年评为教授。目前为中国食品学会第三届青年委员会委员，国际食物营养与安全协会理事，国家国民营养健康专家委员会委员，浙江省国民营养健康专家组副秘书长，全国休闲食品标准化技术委员会委员，浙江省食品学会常务理事，浙江省食品学会青年委员会副主任，浙江省食品添加剂与配料协会专家委员会委员，科技部、国家基金、多省市科技项目评审专家。担任Elsevier旗下Journal of Functional Foods（IF 4.45）刊物编委，食品科学（EI）青年编委，食品研究与开发刊物编委，Food Research International等专刊编辑；近三年相继在 Food Chemistry，Food Hydrocolloid, Trends in Food Science and Technology等主流刊物发表20余篇论文；作为负责人获浙江省科技进步二等奖1项（2020年，排名第一）、中国商业联合会科技进步一等奖2项（2017和2018年，均排名第一）。入选浙江省151人才工程第二层次（2014年）；浙江省院士结对青年英才计划（2019年）；浙江省高校领军人才培养计划（2021）；浙江工业大学健行特聘教授（2022）。

（以上信息来自浙江工业大学食品科学与工程学院官网）

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