在低于100 ℃时，大多数淀粉能够保证一定的颗粒完整性并具备不同的膨胀度，为研究β-淀粉酶对不同晶型膨胀淀粉的水解规律，本文以蜡质玉米淀粉（A型结晶）与马铃薯淀粉（B型结晶）为原料制备膨胀淀粉，探究了β-淀粉酶对膨胀淀粉的水解率、黏度、表观形貌、热力学特性、结晶特性及分子结构的影响。结果表明，β-淀粉酶会利用蜡质玉米膨胀淀粉表面孔隙进行酶解，同时在马铃薯淀粉表面形成凹坑。酶解前马铃薯膨胀淀粉具有更高的膨胀度和黏度，β-淀粉酶对马铃薯膨胀淀粉的水解率高于蜡质玉米膨胀淀粉，最高可达84.28%；差式热量扫描仪（Differential scanning calorimetry，DSC）结果显示，当膨胀温度高于糊化温度时，两种晶型的膨胀淀粉经β-淀粉酶水解后热焓（ΔH）均增加；X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）结果显示酶解未改变两种膨胀淀粉的晶型，但相对结晶度均增加，说明酶解起始于无定形区。同时，蜡质玉米膨胀淀粉和马铃薯膨胀淀粉在酶解后的分支度明显增加，分别从16.51%和13.68%提升至23.08%和30.47%。综上，β-淀粉酶对不同膨胀淀粉均有明显的酶解效果，且对不同晶型淀粉的进攻模式存在差异。
作为最古老且有效的食品保鲜技术，低温贮藏在维持肌肉食品、水果和蔬菜的安全及质量方面发挥着关键作用，根据贮藏环境温度的不同，现代工业中通常以冷藏（0~4 ℃）和冷冻（低于−18 ℃）两种方式来提高产品的品质稳定性。近年来，与传统肉制品相比，调理牛排因其食用方便、营养均衡等优势，越来越受到消费者的青睐。调理牛排产品通常采用冷藏或者冷冻方式进行贮运销售。传统的冷藏技术货架期较短，难以进行长线的冷链运输；此外，尽管冷冻技术可以大幅度延长货架期，但是贮藏过程中冰晶的生长/再结晶会对肌肉组织造成剧烈的机械损伤，解冻后过多的汁液损失会直接损害行业的经济效益和消费者的健康需求。因此，有必要开发新型的低温保存技术以维持食品原有的品质。
淀粉是自然界中含量丰富的生物大分子，广泛应用于食品、制药、造纸等领域。天然淀粉由直链淀粉与支链淀粉形成半结晶结构，其晶型可分为A、B、C 三种，其中 A 型淀粉的双螺旋结构较为致密，且颗粒表面存在较多孔隙；B 型淀粉的双螺旋结构较为松散，且颗粒表面光滑，容易受水、热等外界影响；C 型淀粉为 A 型和 B 型的混合。然而，天然淀粉难溶于水、糊化后容易老化等特点限制了淀粉的应用，常需要对其进行改性处理。其中，酶法改性专一性强、副产物少、环境友好，具有更好的应用前景。研究发现，淀粉的酶解特性与其晶型结构、颗粒形态以及孔隙率等密切相关。淀粉在水热处理后会膨胀、糊化，失去原有的结晶结构，变得更加松散，从而利于酶的吸附与水解。
β-淀粉酶是一种外切酶，它从淀粉的非还原端末端开始依次切割 α-1,4 糖苷键，释放麦芽糖单元，其不能越过分支点进行水解，与其他淀粉酶相比，β-淀粉酶更能实现淀粉的可控酶解。此外，β-淀粉酶能够有效地缩短淀粉的外链，提高分支密度，从而延缓葡萄糖的释放速率。Li 等利用 β-淀粉酶探究了藜麦淀粉支链的精细化结构，发现 DP 6-36 的支链含量与淀粉的结晶区片层厚度呈正相关，而 DP 26-55 的支链含量与无定形区片层的厚度呈正相关；肖瑀等通过 β-淀粉酶与 α-淀粉酶及葡萄糖苷转移酶的联用酶解红薯淀粉，结果显示淀粉的平均链长显著下降，分支密度明显增加，说明 β-淀粉酶具有通过提高分支度，降低淀粉消化性的潜能。
目前关于淀粉酶解的研究多聚焦于完全糊化淀粉，但是完全糊化的淀粉黏度高，流动性差，容易出现酶解不均匀的现象。有研究证明，淀粉颗粒的膨胀能够加速酶解，如 Li 等研究了葡萄糖淀粉酶对不同膨胀度的普通玉米淀粉的影响，发现淀粉的部分膨胀增强了酶的水解作用，且在水解前期尤为明显。考虑到温度和晶型都是影响淀粉酶解特性的重要因素，本研究采用 β-淀粉酶，以蜡质玉米淀粉（WMS）与马铃薯淀粉（PS）为原料，在不同温度下制备膨胀淀粉，探究不同膨胀温度与晶型对 β-淀粉酶水解淀粉规律的影响，旨在为淀粉酶解提供新思路与理论依据。
2.1 温度对不同晶型淀粉膨胀度及黏度的影响
图 1 为不同温度下淀粉的膨胀度及黏度。从图 1A 中可以看出，在较低温度下，两种淀粉膨胀度增加均不明显，但在较高温度下膨胀度大幅增加。其中，WMS 从 65 ℃ 开始明显增加，在 75 ℃ 时达到27.51 g/g，PS 膨胀度从 60 ℃ 开始明显增加，在 75 ℃时达到 48.56 g/g，而 WMS 的糊化温度为 63.59 ℃，PS 的糊化温度为 58.34 ℃，说明淀粉达到糊化温度，有大量水分子进入，膨胀度大幅增加。有研究表明，PS 中含有磷酸基团，它们的存在能够使淀粉快速水合，增强了淀粉的吸水性，使其易于溶胀。此外，淀粉的黏度与膨胀度密切相关，在图 1B 的黏度曲线中，PS 的峰值黏度远高于 WMS，这与 PS 膨胀度大于 WMS 的结果保持一致。
Fig.1 Swelling power (A) and viscosity (B) of starch at different temperatures
图 2 为淀粉在不同膨胀温度与酶解时间下经 β-淀粉酶处理后的水解率。从图 2 中可以看出，随着膨胀温度的升高和酶解时间的延长，WMS 与 PS 的水解率均增加，WMS 最终水解率最高可达 70.42%，PS 最终水解率最高可达 84.28%。此外，两种膨胀淀粉在前 5 h 内的水解速率明显快于后期，原因在于随温度升高，淀粉内部双螺旋结构打开程度加剧，半结晶区逐渐向无定形区转变，易于被 β-淀粉酶水解，但是酶解后期生成的大量底物一定程度上抑制了 β-淀粉酶，从而减缓了水解速率。此外，相同温度下 PS 具有更高的水解率，这是因为 PS 更易水合和糊化，在相同温度下有更加松散的颗粒结构，易于酶的进攻，这与膨胀度（图 1）的结果一致，且上述现象与 Das 等的研究结果相似。
图 2 淀粉在不同膨胀温度与酶解时间下经 β-淀粉酶处理后的水解率
Fig.2 Hydrolysis rate of starch treated with β-amylase under different gelatinization temperatures and enzymatic hydrolysis times
图 3 为酶解前后膨胀淀粉的光学显微图。在酶解前，WMS 为多角形与圆形，而 PS 呈椭圆形，脐点清晰可见；当处理温度逐渐升高时，淀粉吸水膨胀，失去原有形状，偏光十字也逐渐模糊直至消失。图 3中可以看到，相较于 WMS，PS 的膨胀更为剧烈，视野中颗粒大多呈破裂状，与前文膨胀度的结果保持一致。经 β-淀粉酶酶解后，两种淀粉均可观察到少量偏光十字，这是因为膨胀最先发生在淀粉颗粒的无定形区，随后是邻近结晶区的无定形区，最后才是结晶区，而 β-淀粉酶的酶解同样始于无定形区，部分结晶区难以酶解被保留，从而呈现出 WMS-P75-E 与 PS-P70-E 中不完整的偏光十字。
图 4 为酶解前后膨胀淀粉的 SEM 图，可以看到 WMS 表面存在孔隙（WMS-P65），而 PS 表面则更为光滑，这符合 A 型与 B 型淀粉的颗粒特征。随着膨胀温度的升高，两种淀粉表面析出物明显增多，这与温度升高，直链淀粉的溢出增加有关。经酶处理后，视野中两种淀粉颗粒均呈碎片状，与光学显微图（图 3）结果类似。从图 4 中 WMS-P65-E、WMSP75-E 可以看出，β-淀粉酶最初会在 WMS 膨胀淀粉表面形成清晰的酶解孔洞，处理温度的升高会加剧β-淀粉酶对其水解程度，最终导致淀粉颗粒发生破裂。从图 4 中 PS-P60-E、PS-P70-E 中可以看出，β-淀粉酶对 PS 膨胀淀粉的酶解表现为两种形式，其一在高温下会导致 PS 破裂，另一种则仅在淀粉表面留下凹坑而不向内部延伸，上述现象与 Das等观察到的结果一致。此外，两种淀粉样品表面均观察到密集的孔洞，但这并不是 β-淀粉酶酶解形成的孔洞，而是溶剂乙醇在冷冻干燥过程中挥发所导致的。
Fig.3 Morphology of swollen starch under polarized light before and after enzymatic hydrolysis
注：-P 表示分别在 60、65、70、75℃ 下得到的膨胀淀粉；-E 表示进一步被 β-淀粉酶酶解的膨胀淀粉。
Fig.4 Morphology of swollen starch under SEM before and after enzymatic hydrolysis
表 1 为酶解前后膨胀淀粉的热力学特性，ΔH 代表淀粉内部螺旋打开所需要的能量，与原淀粉相比，在膨胀温度低于糊化温度时，WMS 在加热膨胀后 ΔH 增加（WMS-P60），在经 β-淀粉酶酶解后 ΔH下降，这是因为 WMS 在 60℃ 下会受到水热处理产生的韧化作用，短时间的升温促进了淀粉结构向有序化方向重排，ΔH 有小幅度增加；在低温下对膨胀淀粉酶解后 ΔH 下降，可能是因为在淀粉膨胀行为不明显时，A 型淀粉中脆弱的结晶区会与无定形区同时被 β-淀粉酶酶解。在膨胀温度高于糊化温度时，WMS 与 PS 在加热膨胀后 ΔH 均明显下降，当处理温度为 75 ℃ 时，WMS 的热焓从 13.48 J·g−1降至2.34 J·g−1，当处理温度为 70 ℃ 时，马铃薯淀粉的热焓从 17.94 J·g−1降至 2.24 J·g−1。经 β-淀粉酶酶解后，两种膨胀淀粉的 ΔH 均增加，其中样品 WMS-P70-E、WMS-P75-E 及 PS-P60-E 的效果最为显著。经水热预处理过的淀粉 ΔH 明显下降，原因在于淀粉颗粒在加热过程中膨胀，支链逐渐解开双螺旋，破坏分子间氢键所需的能量降低；同时 β-淀粉酶会优先水解两种淀粉的无定型区域，保留难以被水解的结晶区，导致了酶解后 ΔH 的增加。此外，两种膨胀淀粉经酶解后 To、Tp 和 Tc 均增加，说明淀粉在酶解后结晶结构的强度增加，需要更高的熔融温度。值得注意的是，PS-P70-E 因膨胀程度高，酶解程度剧烈，结晶结构被破坏程度大，在 DSC 测试的升温过程中不再呈现明显的糊化行为，其热力学特性低于 DSC 的检测限。
Table 1 Thermal properties of swollen starch before and after enzymatic hydrolysis
图 5 为膨胀淀粉酶解前后的 X 射线衍射图。XRD 可以反映淀粉的长程有序性结构，天然淀粉颗粒的相对结晶度一般为 15%~45%。图 5 中可以看出，酶解前后 WMS 膨胀淀粉均在 15°、17°、18°、23°（2θ）呈现 A 型特征峰，而 PS 膨胀淀粉在 17°、19°、22°、24°、26°（2θ）呈现 B 型特征峰，说明酶解没有改变淀粉的晶型。在不同膨胀温度下，WMS与 PS 的相对结晶度均有下降，其中 PS 的相对结晶度下降的更剧烈，由原淀粉的 29.00% 下降至 5.70%，说明温度预处理一定程度上破坏了淀粉的结晶结构，PS 更容易受到温度的影响。此外，经 β-淀粉酶酶解后，在高于自身糊化温度下制备的膨胀淀粉，其相对结晶度均增加，这主要是在 β-淀粉酶水解过程中，无定形区域优先被酶解，使残留淀粉的相对结晶度增加，肖云鹏等用 α-淀粉酶酶解蜡质玉米淀粉，呈现的酶解结果与本实验相似。上述结论与高温预处理膨胀淀粉的 DSC 结果一致。
Fig.5 X ray diffraction patterns of swollen starch before and after enzymatic hydrolysis
注：A. 酶解前蜡质玉米淀粉；B. 酶解后蜡质玉米淀粉；C. 酶解前马铃薯淀粉；D. 酶解后马铃薯淀粉。
图 6 为两种膨胀淀粉酶解后的分支度。葡萄糖基团上的次、亚甲基质子的化学位移集中分布于3.0~4.0 ppm，而异头碳的氢质子常在 4.5~5.5 ppm 产生化学位移。图 6 中可以看出，本实验中 α-1,4 糖苷键与 α-1,6 糖苷键的化学位移分别为 5.11 ppm 与4.90 ppm。经 β-淀粉酶处理后，两种膨胀淀粉分支度明显提高，WMS 从 16.51% 增加至 23.08%，PS 则从 13.68% 增加至 30.47%，这是因为 β-淀粉酶只能水解 α-1,4 键，不能越过分支点进行酶解，从而使得分支点的比例升高。
Fig.6 Degree of branching of swollen starchafter enzymatic hydrolysis
图 7 为膨胀淀粉酶解后的碘结合能力。根据淀粉与碘结合能力的不同，可以形成蓝色或紫红色两种络合物，这侧面反映了淀粉的聚合程度及分支模式，直链淀粉-碘结合物与支链淀粉-碘结合物的吸收峰分别位于 540~660 nm 及 500~540 nm。图 7A可以看出，蜡质玉米淀粉-碘络合物的最大吸收波长位于 530~540 nm，而图 7B 中马铃薯淀粉-碘络合物最大吸收波长位于 567~617 nm，说明相较于PS，WMS 及其酶解产物中有更高含量的支链淀粉。随着膨胀温度的升高，蜡质玉米淀粉-碘络合物的吸光度从 0.176 下降至 0.133，而马铃薯淀粉-碘络合物的吸光度由 3.309 下降至 0.940，表明经 β-淀粉酶酶解后，两种晶型膨胀淀粉中的长直链淀粉含量下降。β-淀粉酶酶解速率随温度增大的过程中，两种膨胀淀粉短链含量增高，螺旋匝数减少，能够容纳的碘分子数下降，从而导致了吸光度的下降。
图 7 蜡质玉米（A）与马铃薯（B）膨胀淀粉酶解后的碘结合能力
Fig.7 Iodine-binding capacity of waxy maize starch (A) and potato swollen starch (B) after enzymatic hydrolysis
注：1：WMS；2：WMS-P60-E；3：WMS-P65-E；4：WMS-P70-E；5：WMS-P75-E；6：PS；7：PS-P55-E；8：PS-P60-E；9：PS-P65-E；10：PS-P70-E。
通过以上实验结果，推测 β-淀粉酶对两种晶型膨胀淀粉的水解机理如图 8 所示。β-淀粉酶对两种高温膨胀淀粉酶解，均可以导致淀粉颗粒的破裂。但当膨胀温度较低时，β-淀粉酶对两种淀粉的进攻模式存在差异。由于 WMS 表面存在直径为 5~400 nm，能够连接淀粉表面与脐点的孔隙，分子粒径较小的 β-淀粉酶分子能够随机吸附于 A 型淀粉表面的微孔，随酶解的进行微孔不断扩大，更多的酶分子沿通道进入淀粉内部，使膨胀淀粉被进一步水解；而PS 作为一种 B 型淀粉，其形貌光滑没有孔洞，但由于马铃薯淀粉的结晶结构不如蜡质玉米淀粉致密，在膨胀状态下表面更为脆弱，β-淀粉酶能够随机进攻颗粒表面，并在表面形成凹坑。
图 8 β-淀粉酶对不同晶型膨胀淀粉的水解机理示意图
Fig.8 Mechanism of hydrolysis of different crystalline swollen starches by β-amylase
本研究发现 β-淀粉酶对不同晶型膨胀淀粉的酶解特性存在差异，β-淀粉酶对两种淀粉呈现不同的作用机制，其通过扩大表面孔隙酶解 WMS 膨胀淀粉，而对 PS 膨胀淀粉则是在表面形成凹痕；另外，PS 比WMS 对温度更为敏感，这一特性使其表现出更高的膨胀度和黏度；PS 膨胀淀粉的水解率高于 WMS 膨胀淀粉，最高可达 84.28%；在较高膨胀温度下，酶解使得两种膨胀淀粉吸热焓和相对结晶度均增加，说明酶解后结晶结构变得更加有序；酶解还明显增加了 WMS 与 PS 膨胀淀粉的分支度，分别从 16.51% 和13.68% 提升至 23.08% 和 30.47%；同时，两种膨胀淀粉的碘结合能力下降，蜡质玉米淀粉-碘络合物的吸光度从 0.176 下降至 0.133，而马铃薯淀粉-碘络合物的吸光度由 3.309 下降至 0.940，说明酶解降低了淀粉中的长直链含量。本文研究结果可拓展淀粉新型酶解思路，为不同晶型的淀粉酶解提供理论依据，另考虑到 β-淀粉酶能够改变淀粉的分支密度，后续将进一步探究利用 β-淀粉酶与其他淀粉酶复配生成新型抗消化糊精的可能。
引用本文：王心宇，邵苗，蒋义，等. β-淀粉酶对不同晶型膨胀淀粉的水解规律[J]. 食品工业科技，2025，46（16）：37−45. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024110290.
Citation: WANG Xinyu, SHAO Miao, JIANG Yi, et al. Hydrolysis Patterns of Different Crystalline Swollen Starches by β-Amylase[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(16): 37−45. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024110290.
基金项目：国家重点研发计划项目（2022YFC2805100）。
黄强，教授，博导，现任华南理工大学食品科学与工程学院院长、国家热带特色健康食品国际科技合作基地常务副主任。主要从事功能碳水化合物领域的教学和科研工作，包括淀粉高值化利用、食品活性成分微胶囊包埋和缓释评价、乙烯调控和果蔬保鲜；抗性淀粉、慢消化淀粉与肠道健康等。主持完成国家和部省级项目20余项，共发表SCI收录论文180余篇，其中热点论文1篇，高被引论文8篇，被引16000余次，H指数75，入选爱思唯尔全球前2%顶尖科学家和科睿唯安高被引科学家，授权中国发明专利38件，美国发明专利1件，国际PCT 6件，出版教材、专著4部，英文专著2部，参与制定变性淀粉和全谷物食品行业标准5件，获得中国专利优秀奖（2015）、广东省科技进步一等奖（2019）和中国轻工业联合会科技进步一等奖（2022）。
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