国家重点研发|中国测试技术研究院周李华研究员、成都大学谢贞建副教授：即食果蔬制品中致泻大肠埃希氏菌检测微滴数字PCR系统的建立

食品工业科技编辑部

2025-11-28

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本文获国家重点研发计划项目（2021YFF0701905）。

摘要

传统的致泻大肠埃希氏菌检验方法耗时较长，为缩短检测时间，构建了含致泻大肠埃希氏菌bfpB、ipaH、stp特征基因的质粒DNA标准物质候选物，针对bfpB、ipaH、stp基因建立一套可实现快速检测的微滴式数字PCR系统。用微滴数字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）进行引物探针浓度和退火温度等体系优化后，以梯度稀释的质粒DNA为模板评估方法的线性相关性和精密度，添加非目标基因invE、sth为模板验证方法特异性，并将构建的ddPCR方法用于即食果蔬制品的实际检测。结果表明，bfpB、ipaH、stp质粒DNA最优引物终浓度均为400 nmol/L，最优探针终浓度分别为200、100、200 nmol/L；bfpB、ipaH、stp质粒DNA最优退火温度分别为60、58、58 ℃；特征基因bfpB、ipaH、stp分别在8.87~38700.00、3.33~36533.33、6.57~61833.33 copies/μL浓度范围呈线性相关，浓度梯度的线性相关系数r值均大于0.99；bfpB、ipaH、stp基因的定量限分别为15.33、7.97、15.00 copies/μL，检出限分别为8.87、3.33、6.57 copies/μL；方法精密度小于5%，特异性良好；实际样品检测结果显示，未加标样品未检出，而加标样品及阳性对照均可检出，ddPCR方法检测结果与国标方法检测结果一致。建立的方法可大大缩短致泻大肠埃希氏菌的检测时间，为食品中致泻大肠埃希氏菌的快速检测提供技术参考。

作为最古老且有效的食品保鲜技术，低温贮藏在维持肌肉食品、水果和蔬菜的安全及质量方面发挥着关键作用，根据贮藏环境温度的不同，现代工业中通常以冷藏（0~4 ℃）和冷冻（低于−18 ℃）两种方式来提高产品的品质稳定性。近年来，与传统肉制品相比，调理牛排因其食用方便、营养均衡等优势，越来越受到消费者的青睐。调理牛排产品通常采用冷藏或者冷冻方式进行贮运销售。传统的冷藏技术货架期较短，难以进行长线的冷链运输；此外，尽管冷冻技术可以大幅度延长货架期，但是贮藏过程中冰晶的生长/再结晶会对肌肉组织造成剧烈的机械损伤，解冻后过多的汁液损失会直接损害行业的经济效益和消费者的健康需求。因此，有必要开发新型的低温保存技术以维持食品原有的品质。

致泻大肠埃希氏菌（Diarrheagenic Escherichia coli，DEC）是一种与食源性疾病有关的常见病原体，某些菌株可表现出致病的毒力因子。每种大肠埃希氏菌病理类型都有其特有的致病机制，根据其毒力因子、临床表现和流行病学特征可分为五种主要的病理类型：肠致病性大肠埃希氏菌（Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（Enteroinvasive Escherichia coli，EIEC）、产肠毒素大肠埃希氏菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）、产志贺毒素大肠埃希氏菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）、肠集聚性大肠埃希氏菌（Enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）；bfpB、ipaH、stp三种基因分别对应的致泻大肠埃希氏菌类型为EPEC、EIEC、ETEC。若食用被致泻大肠埃希氏菌污染的食物会引发肠道疾病、炎症甚至癌症，该致病菌主要通过动物源性新鲜食物、水果或蔬菜等传播，是常见的细菌性食源性疾病致病因子之一。

即食果蔬制品因其工艺简单、方便等特点广受消费者喜爱，但去皮、切片等前处理使其与空气的接触面增大，易受致病微生物污染。有学者分别在凉拌菜和鲜切果蔬的抽检中检出致泻大肠埃希氏菌，该结果表明即食果蔬制品中存在大肠埃希氏菌污染的风险较大。根据国情不同，各国对致泻大肠埃希氏菌有不同的限量要求，我国食品安全国家标准GB 29921-2021《预包装食品中致病菌限量》中规定，即食果蔬制品中致泻大肠埃希氏菌不可检出，而国外如美国对即食食品中致泻大肠埃希氏菌的限量要求主要按产品类别而定，欧盟的食品微生物标准（EC） No 2073/2005对其也有相应要求。对致泻大肠埃希氏菌进行定量检测，可根据其浓度判断食品是否在安全范围内，是食品质量控制的重要手段。食用被致泻大肠埃希氏菌污染的食物极可能引发严重的食源性疾病，因此食品中致泻大肠埃希氏菌的检测至关重要。

目前我国现行有效与食品相关的大肠埃希氏菌检测标准包括国家标准、行业标准等主要以传统方法检测为主，传统的微生物学检测方法大概需要2~7 d才能得到结果，耗时长、操作复杂，且存在标准缺失和落后等问题，易引发错检和漏检等问题，难以对食品安全状况进行高效且精准的评估。在常规检测方法的基础上增加分子生物学方法或联合其他多种方法进行检测逐步成为食源性致病菌的重要检测手段，基于核酸的分子诊断技术可使病原体的准确检测更加快捷。目前，进出口行业标准SN/T 5225-2019《进出口食品中五种致泻大肠埃希氏菌快速检测方法》中采用的多重PCR方法无法实现绝对定量，且检测过程繁琐；实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）由于依赖标准曲线而影响结果的准确性，且易出现假阳性或假阴性结果。微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）通过将反应物分成数千个液滴来定量DNA样品中靶序列拷贝数，具有高灵敏度、高特异性和绝对定量等优点。ddPCR与其他方法相比可实现对起始样品的精准分析，能够绝对定量目标靶标，降低假阴性风险，且仅需3~5 h即可完成一次试验，大幅度缩短了检测时间，更适用于复杂的食品基质，在食源性致病菌检测领域被广泛应用。

本文通过制备致泻大肠埃希氏菌bfpB、ipaH、stp质粒标准物质候选物，以qPCR平台分别筛选各质粒DNA的3对引物探针，确定最适用的引物探针，后经ddPCR系统对各引物探针浓度及退火温度等进行优化，加入非目标基因invE和sth为模板验证方法特异性，考察方法的线性，评估定量限、检出限和精密度，构建一种快速检测三种致泻大肠埃希氏菌的微滴式数字PCR系统，并将构建的ddPCR方法用于检测鲜切水果和凉拌菜中致泻大肠埃希氏菌以验证方法可行性，为EPEC、EIEC和ETEC的快速检测提供实验参考。

结果与分析

2.1 DNA质量评估结果

重组质粒提取后经微量核酸蛋白测量仪检测质量，并用1%（m/V）琼脂糖凝胶电泳验证质粒DNA片段大小。

结果表明，bfpB、ipaH、stp质粒标准物质候选物的纯度符合要求（表3）；电泳分析结果（图2）中可以看到明亮且清晰、无杂带、无拖尾、无弥散、无弯曲的目的DNA条带，且目的DNA条带位置与预期相符，即bfpB（4382 bp）、ipaH（4447 bp）、stp（3811 bp）。各质粒DNA质量评估结果表明本研究提取制备的质粒DNA浓度和纯度均符合要求，可用于微滴式数字PCR方法建立。

表 3 质粒DNA纯度测定结果

Table 3 Results of plasmid DNA purity determination

图 2 bfpB、ipaH、stp质粒DNA电泳分析结果

Figure 2. Results of DNA electrophoresis analysis of bfpB, ipaH, and stp plasmids

注：M. DL 5000 DNA Marker。

2.2 qPCR和ddPCR初步筛选引物探针

结合qPCR和ddPCR初步筛选结果选择各质粒DNA实时荧光PCR扩增S型曲线线型较好、Ct值小、RSD值符合要求、扩增效率高且数字PCR检测结果无明显“下雨”现象的引物探针作为各质粒DNA的最适引物探针，具体信息见表1，荧光基团选择FAM，猝灭基团选择BHQ1。

2.3 数字PCR反应条件优化结果

以bfpB、ipaH、stp质粒DNA标准物质候选物为扩增模板，参照1.2.4中引物和探针的终浓度组合进行优化，结果显示，当bfpB、stp质粒DNA上下游引物终浓度和探针终浓度组合为400 nmol/L-200 nmol/L；ipaH质粒DNA上下游引物终浓度和探针终浓度组合为400 nmol/L-100 nmol/L时；微滴式数字PCR阴、阳性微滴区分较好（图3），且拷贝数结果高（图4a），RSD值符合要求（图4b），重复性好，所得结果较理想，因此确定上述终浓度为bfpB、ipaH、stp质粒DNA各引物探针的最佳浓度组合。

图 3 bfpB（a）、ipaH（b）、stp（c）质粒引物探针最优终浓度的ddPCR扩增图

Figure 3. ddPCR amplification plots of the optimal final concentrations of the bfpB (a), ipaH (b), and stp (c) plasmid primer probes

图 4 bfpB、ipaH、stp质粒不同引物探针终浓度组合的检测结果

Figure 4. Detection results of different primer probe final concentration combinations for bfpB, ipaH, and stp plasmids

注：a. 拷贝数均值；b. RSD值。

在62~51 ℃的温度范围内设置8个退火温度：62、61.2、59.8、57.7、55.2、53.1、51.8、51 ℃，以bfpB、ipaH、stp质粒DNA为模板、优化后的引物探针终浓度进行微滴式数字PCR扩增，每个温度点设置3个重复，退火温度优化结果（图5）显示，bfpB退火温度为60 ℃（59.8 ℃），ipaH、stp退火温度为58 ℃（57.7 ℃）时无明显“下雨现象”，拷贝数结果较高且RSD值符合要求（图6），重复性好，因此确定上述退火温度为bfpB、ipaH、stp质粒DNA的最适退火温度。

图 5 bfpB（a）、ipaH（b）、stp（c）质粒最优退火温度的ddPCR扩增图

Figure 5. ddPCR amplification plots of optimal annealing temperatures for bfpB (a), ipaH (b), and stp (c) plasmids

图 6 bfpB、ipaH、stp质粒不同退火温度的检测结果

Figure 6. Detection results of different annealing temperatures for bfpB, ipaH, and stp plasmids

注：a. 拷贝数均值；b. RSD值。

2.4 qPCR和ddPCR特异性检测结果

分别以bfpB、ipaH、stp质粒DNA为模板，经qPCR和ddPCR扩增致泻大肠埃希氏菌的特征基因invE、sth、bfpB、ipaH、stp以验证其特异性。

qPCR检测结果（图7a、b、c）显示，引物探针bfpB只扩增bfpB基因；引物探针ipaH只扩增ipaH基因；引物探针stp只扩增stp基因，特异性良好，所筛选的各引物探针可用于数字PCR方法建立。据ddPCR扩增结果（图7d、e、f）显示，除相对应的目标基因显示阳性外，其余基因均为阴性，表明本研究建立的微滴式数字PCR方法特异性良好。

图 7 bfpB（a、d）、ipaH（b、e）、stp（c、f）质粒qPCR及ddPCR特异性扩增结果

Figure 7. Specific amplification results of bfpB (a, d), ipaH (b, e), stp (c, f) plasmid qPCR and ddPCR

2.5 定量限、检出限、线性范围验证

以bfpB、ipaH、stp质粒DNA为扩增模板，根据优化好的ddPCR程序进行检测。检测结果见图8，在20 μL反应体系中，bfpB、ipaH、stp基因分别在8.87~38700.00、3.33~36533.33、6.57~61833.33 copies/μL范围内理论样本浓度与实际样本浓度具有良好的线性相关性，bfpB、ipaH、stp三个基因拟合的线性相关系数r值分别为0.9938、0.9991、0.9996。

图 8 bfpB、ipaH、stp质粒ddPCR梯度稀释线性图谱

Figure 8. Gradient dilution linear maps of bfpB, ipaH, and stp plasmids ddPCR

在线性动态范围内，能可靠检测且RSD≤25%的样品最低浓度值确定为bfpB、ipaH、stp的定量限，能被稳定检出的最小浓度且至少2个微反应体系为阳性信号的值确定为检出限。由样本浓度的检测结果估计，bfpB、ipaH、stp的定量限分别为15.33、7.97、15.00 copies/μL；检出限分别为8.87、3.33、6.57 copies/μL，检出限满足至少有2个复孔均为阳性，定量限符合RSD≤25%，该方法可用于检测致泻大肠埃希氏菌bfpB、ipaH、stp三种特征基因。

2.6 精密度检测结果

100倍梯度稀释质粒标准物质候选物，根据优化后的ddPCR方法检测bfpB、ipaH、stp质粒DNA标准物质候选物的103 copies/μL样品，重复检测7次，检测结果见表4，方法的RSD均小于5%。

表 4 bfpB、ipaH、stp质粒ddPCR精密度检测结果（copies/μL）

Table 4 Precision detection results of bfpB, ipaH, stp plasmid ddPCR (copies/μL)

2.7 样品检测结果

用构建的ddPCR方法及传统方法检测了鲜切水果和凉拌菜共计50份，编号1~50，具体样品信息见图9。检测结果（表5）显示，1~50号样品未检出，均未超标，阳性对照及加标样品51~56检出阳性。ddPCR检测结果显示，各阳性对照（57号、58号、59号）可稳定扩增，呈阳性，检出限分别为8.87、3.33、6.57 copies/μL。加入肠致病性大肠埃希氏菌（编号51和52）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（编号53和54）和产肠毒素大肠埃希氏菌（编号55和56）的样本分别检出bfpB、ipaH和stp，与国标方法检测结果一致，两种方法均可检出致泻大肠埃希氏菌bfpB、ipaH、stp基因，ddPCR方法检出51/52、53/54、55/56号加标样品含量分别在25.06/24.73、28.32/30.59、26.37/28.40 copies/μL，结果表明研究建立的ddPCR方法可用于即食果蔬制品中致泻大肠埃希氏菌的检测。

图 9 ddPCR检测用样品

Figure 9. Samples for ddPCR detection

表 5 样品ddPCR方法及国标方法检测结果

Table 5 Detection results of the sample ddPCR method and the national standard method

注：表中“+”表示检出相对应的毒力基因；“−”表示未检出。

结论

本研究通过制备致泻大肠埃希氏菌bfpB、ipaH、stp质粒DNA标准物质候选物，构建了一种用于检测致泻大肠埃希氏菌bfpB、ipaH、stp三种特征基因的ddPCR系统，可通过检测bfpB、ipaH、stp三种特征基因定位致泻大肠埃希氏菌的病理类型。bfpB、stp的最适上下游引物及探针终浓度分别为400 nmol/L和200 nmol/L；ipaH的最适上下游引物及探针终浓度分别为400 nmol/L和100 nmol/L；bfpB、ipaH、stp的最适退火温度分别为60、58、58 ℃；对方法的动态范围进行了验证，bfpB、ipaH、stp分别在8.87~38700.00、3.33~36533.33、6.57~61833.33 copies/μL浓度范围呈线性相关，且线性相关系数r值均大于0.99；bfpB、ipaH、stp基因的定量限分别为15.33、7.97和15.00 copies/μL；检出限分别为8.87、3.33及6.57 copies/μL；方法的精密度小于5%，具有良好的特异性；50份未加标样品均未超标，阳性对照及加标样品检出bfpB、ipaH、stp基因，与国标方法检测结果一致，该方法可用于检测即食果蔬制品以判断该类食品中致泻大肠埃希氏菌的污染情况。本研究建立的微滴式数字PCR方法可实现致泻大肠埃希氏菌的定量检测，检测过程仅需3~5 h，大大缩短了检测时间，且有望降低错检风险，为食品中致泻大肠埃希氏菌快速检测方法相关标准的形成提供了参考，在一定程度上有利于相应目标菌检测标准的建立，有助于推进微滴式数字PCR检测技术的广泛应用，为致泻大肠埃希氏菌的快速检测和防控提供重要的技术参考。

引用本文：张雪，马丽侠，叶德萍，等. 即食果蔬制品中致泻大肠埃希氏菌检测微滴数字PCR系统的建立[J]. 食品工业科技，2025，46（21）：357−365. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024100338.

Citation:ZHANG Xue, MA Lixia, YE Deping, et al. Establishment of a Droplet Digital PCR System for the Detection of Diarrheagenic Escherichia coli in Ready-to-Eat Fruit and Vegetable Products[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(21): 357−365. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024100338

通讯作者简介

周李华，研究员，九三学社社员。中国测试技术研究院生物研究所所长。全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）秘书长，国际生物技术标准化技术委员会（ISO/TC 276）委员，国际中药标准化技术委员会（ISO/TC 249）委员，国际具有生物杀灭和抗菌特性的表面标准化技术委员会（ISO/TC 330 ）委员。长期致力于生物医药计量测试技术与标准化研究，主持或作为项目实施负责人完成国家级、省部级科研项目20余项，获省部级科技进步奖6项（二等奖4项、三等奖2项）。牵头制定国家标准18项，主导制定国际标准3项、欧洲药典标准2项，研制国家标准物质16种，多项技术成果填补领域空白并广泛应用。

（信息来自中国测试技术研究院官网）

谢贞建，男，成都大学食品与生物工程学院副教授，硕士生导师，主要从事天然产物功能活性成分研究、食品药品安全分析检测。主讲《仪器分析实验》、《食品分析及实验》、《无机化学实验》、《分析化学实验》等课程。近年参与国家自然科学基金项目、国家科技部项目、四川省科技计划项目等8项，在国内外重要学术期刊发表论文30余篇，授权国家发明专利7件，制定国家标准1项。