基于上转换纳米粒子的多光子超分辨显微镜- 大数跨境

两江科技评论

2018-08-22

导读：最近，澳大利亚悉尼科技大学（UTS）的研究者通过对大量前期工作的拓展延伸，结合材料科学，化学合成，光子物理和生物样品成像，运用一个崭新的光学物理机理实现了透过深层组织进行超分辨率成像的目的（厚度100

导读

最近，澳大利亚悉尼科技大学（UTS）的研究者通过对大量前期工作的拓展延伸，结合材料科学，化学合成，光子物理和生物样品成像，运用一个崭新的光学物理机理实现了透过深层组织进行超分辨率成像的目的（厚度100微米，分辨率50纳米）。该项多学科交叉的研究成果相关工作以“Multi-photon near-infrared emission saturation nanoscopy using upconversion nanoparticles”为题，发表于最新一期的《Nature Communications》上。

文DOI: 10.1038/s41467-018-05842-w

共同第一作者：陈朝浩、王帆博士

共同通讯作者：王帆博士、金大勇教授

A-上转换超分辨成像

悉尼科技大学金大勇教授课题组（后文简称“课题组”）的前期工作发现，用相对高强度的激发光可以缓解上转换颗粒发光的浓度淬灭这个现象，从而课题组研究者们将普偏认为的最优活化剂浓度（铥离子Tm³⁺）从0.5%提高到了8%（参考课题组另外两篇文章，Nature Nanotechnology 2013, 10, 729-734；Nature Communications 2018, 9:2415）。这可以显著提高上转换颗粒的发光信号，让单颗粒成像成为了可能。早在2012年，课题组便在组内提出利用上转换颗粒做低功率激发超分辨成像这个课题。与北京大学席鹏研究员课题组合作历时五年不断的摸索试验，最终成功利用上转换颗粒实现低功率STED超分辨显微镜（Nature 2017, 543, 229–233）。

B-

多光子超分辨显微镜

在金大勇教授和王帆博士的指导下，课题组决定利用上转换颗粒激发波长长的特点，开发深组织超分辨成像显微技术。因长波长红外光的高穿透性，多光子显微镜已经被生物学家广泛的运用于实验中。但由于衍射极限的存在，多光子显微镜的分辨率比传统的单光子共聚焦要低的多。这使得研究者看不见深组织下的更精细的结构。几年前，就有其他课题组尝试着结合STED技术实现多光子超分辨成像。然而这个技术的表现却不尽人意，其瓶颈在于传统的多光子染料吸收效率太低，从而需要很强的激发光来实现超分辨成像。

C-研究的出发点

上转换颗粒中参杂的镱离子（Yb³⁺）可以线性吸收长波长的红外光，将其传递给铥离子来发出短波长的可见光。不同于传统的多光子染料，镱离子有着较大的吸收截面。另外，因为铥离子的多个长寿命态的存在，镱离子线性吸收的光子可以传递给铥离子，实现多光子发光。因此上转换颗粒可以被比传统多光子染料低几个数量级的功率激发。前面提到过，金大勇课题组去年发表了低功率的上转换颗粒STED超分辨成像。但是由于荧光波长是455nm，限制了其在深组织超分辨成像里的应用。由于上转换材料的特性，它有着非常广的发光谱。王帆博士设想着是否可以利用到这点，采集700nm以上的荧光信号来实现深组织超分辨成像。通过深入研究上转换颗粒的能级体系，王帆博士以及学生陈朝浩发现利用体系发光的非线性饱和以及高稳定饱和态，可以实现一种新型的全红外超分辨成像技术，即激发光（980nm）与发射光（800nm）均处于红外波段。并且这个系统只需要一束“甜甜圈”光束就可以成像。这会大大增加了系统的稳定性，也减少了系统搭建的复杂程度。在确定了想法之后，课题组开始根据王帆博士的模拟结果合成以及测试材料。经过反复的材料合成以及系统优化，朝浩把最佳分辨率提高到了接近30纳米。在悉尼大学Prof. Jackson课题组的帮助下，王博士和朝浩继而把刚开放的方法放到了深组织成像。第一次实现了100微米组织深度之下的单纳米颗粒超分辨成像。这个结果让课题组非常兴奋，因为它在纳米药物以及生物力学方向有绝佳的应用。

D-

文章的整理

前文简述了多光子近红外荧光饱和显微镜（NIRES）这个课题的形成与发展，这也基本是这篇论文的思路。这个工作属于典型的跨学科研究，在这个工作中金大勇教授和王帆博士作为导师起到了至关重要的作用。他们用深，广的知识储备构架了文章的逻辑性。博士生朝浩在此工作中也起到了非常重要的作用，他勤恳态度和优选的能力保证了工作的质量以及较快的科研周期。基于扎实的光学系统以及材料理论功底，王帆博士在此工作中设计并指导搭建了成像系统，并且实现了成像系统的理论模拟，构建了此工作的框架。这个工作也体现了跨学校多课题组合作的重要性，悉尼大学以及北京大学提供了研究技术上的互补。本文最终是从多光子显微镜出发，结合上转换颗粒的较传统多光子染料而言较高的吸收截面特点，为深组织超分辨成像及单分子追踪提供了一个简单的解决方案。

结果与讨论

Figure 1| The energy densities required by various probes fordeep tissue super-resolution imaging. In order tofacilitate the comparison, we normalize the excitation/depletion power tocertain pulse period (200 fs) through 100 μm tissue. Thered and blue curves show the light effective attenuation coefficient in thetissue. 1PE, one-photon excitation; 2PE, two-photon excitation; QD, quantumdots; FP, fluorescence protein; SEMI, semiconductor nanowiressegments.

研究团队首先比较了在100微米组织深度下的相同条件下，不同材料的超分辨成像所需要的激发和淬灭光能量。短波长在组织里光衰减比较严重，所以需要较大的激发能量。而多光子材料因为其较低的吸收截面，也需要极大的激发光功率。获利于其红外激发及较大的吸收截面，上转换材料纳米颗粒为低功率深组织超分辨成像提供了一种可行性。

Figure 2| The principle of NIRES nanoscopy using UCNP asmulti-photon probe for deep tissue imaging.(a) The simplified energy levels andupconversion process of Yb³⁺ and Tm³⁺co-doped UCNPs. The sensitizer Yb³⁺ions initiate the photon upconversion process by a linear and sequential absorption of 980 nm excitation. Dueto the multiple long-lived intermediate states, the energy is stepwise transferred onto thescaffold energy levels of emitters Tm³⁺, eventually facilitatemultiphoton upconversion emission, including emissions from the four photonupconversion excited state ¹D₂ (455 nm), three photonstate ¹G₄ (470 nm), and two photon excited state ³H₄(800 nm). (b) The saturationintensity curve of the 800 nm emissions from UCNPs (40 nm NaYF₄: 20%Yb³⁺, 4%Tm³⁺) under 980 nm excitation. (c) Cross-section profiles of thesaturated upconversion emission of UCNPs at four different excitation powers of0.1 MW cm^-2, 0.4MW cm^-2, 1 MW cm^-2 and 3MW cm^-2. (d) The simulated ‘negative’ contrastimages of the cross-section profiles of a single UCNP. Pixel size, 10 nm. Scalebar is 500 nm.

NIRES显微技术利用了上转换颗粒多中间态阶梯能级的特点。³H₄能级下来的800nm荧光饱和曲线显示，该波段荧光在较低功率的980nm激发光便有响应，且荧光上升斜率大便容易达到饱和状态，这反映其是非线性光子上转换过程。课题组先将高斯激发光用涡旋相位片调制成“甜甜圈”状的中空光束，然后再对上转换颗粒进行扫描。只有当颗粒位于光束中间时，NIRES显微镜产生一个环形暗斑的图案。这里课题组把测量得到的单个上转换颗粒的点扩散函数（PSF）中间暗斑的半峰全宽（FWHM）定义为NIRES显微镜的实验分辨率。利用非线性饱和特性，NIRES显微镜的光学分辨率很容易通过提高激发光功率来突破衍射极限。

研究者们发现在一定激发功率下，NIRES显微镜的分辨率由材料的荧光饱和度曲线决定。在他们的实验中，该曲线有三个特征影响分辨率。第一个特征是功率点（I_S），即实现荧光饱和的激发功率强度的一半值。第二个特点是功率点（I_MAX），即对于固定I_S来说实现荧光饱和的激发功率强度。换句话说，较小的I_MAX表示I_S和I_MAX之间曲率更超线性。第三个特征是曲线的起始值，课题组定义它为功率点I_S的e^-2强度。较大的起始值表示0和I_S之间的曲率更不线性。较低的I_S和/或I_MAX值减小了环形图案中暗点的大小，从而提高分辨率。

Figure 3| Super-resolution scaling ∆r of UCNPsas a function of the excitation power (intensity). Thedots of experimental data are fitted well to the simulation results (solidlines). Errorbars are defined as s.d. from line profiles of several measurements. Insets, NIRES images of 8% Tm³⁺ doped UCNPs at 5.5 MW cm^-2(left), 4% Tm³⁺ one at 4 MW cm^-2 (middle), and the corresponding cross section profile lines (right).Pixel dwell time, 3 ms; pixel size, 10 nm. Scalebar is 500 nm. The series of NaYF₄: 20% Yb³⁺,x% Tm³⁺ UCNPs (x = 2, 4, 6, and 8) ~40 nm in diameter arecontrolled synthesized and characterized.

研究团队通过模拟计算发现，可以通过调整Tm³⁺的参杂浓度来优化荧光饱和曲线，从而在材料层面上提高分辨率。同时他们也发现，NIRES显微镜的分辨率可以通过提高Yb³⁺浓度或设计核壳结构来进一步优化，这为材料科学研究超分辨成像提供了广阔的空间。

Figure 4 | The optical resolution ofdifferent imaging modalities at different depth of a liver tissue slice. (a) An illustration of a mouse liver tissue slice with 93 µmthickness. (b) Single particleimaging at different depth in liver tissue. Left, confocal images from 455 nmemission; middle, confocal images from 800 nm emission; right, thecorresponding NIRES images. (c) Thenormalized emission attenuation at different depth through the liver tissue. (d) The corresponding FWHM in (b); The resolutions of NIRES in (d) are 49.6 ± 11.1 nm(0 µm), 42.4 ± 6.2 nm (15µm), 42.4 ± 7.2 nm (55 µm), 48.0 ± 7.3nm (75 µm), 38.2 ± 14.3 nm (93µm).Benefiting from the controlled synthesis ofintensity monodispersed UCNPs, each single nanoparticle can be distinguishedfrom their clusters from clusters by comparing their emission intensity tostatistical averaged value.Error bars are defined as s.d.. Pixel dwell time for confocaland NIRES is 3 ms. The pixel size for confocal and NIRES is 10 nm. The scale baris 500 nm.

然后，研究团队测试了NIRES显微镜在深组织里的穿透深度及成像分辨率。结果表明，在穿过93微米的组织切片后，455nm的荧光只剩下11%的光强，而800nm 的荧光还有接近40%。由于近红外光在组织里的低折射率（散射），NIRES可以一直稳定在50纳米以下的超高分辨率。接着研究团队又通过解析在深组织里的上转换颗粒团，更进一步地测试了NIRES显微技术的可靠性。在肝组织切片88微米深度处，NIRES显微镜可以轻易解析出单个颗粒，而普通的共聚焦显微镜在这个深度已经无法分辨单个颗粒了。

Figure 5 | NIRES nanoscopy for superresolution imaging of single UCNPs through deep mouse liver tissue. (a) Bright field and fluorescence wide field image of UCNPs at 88 µmdepth inside a mouse liver tissue slice. (b)Confocal images of a 6 μm×6 μm area containing clusters of UCNPs. (c) and (d) are the zoom-in confocal images of two areas of interest from (b). (e) and (f) are the rawdata of NIRES images of (c) and (d). (g) and (h) are theprocessed data of NIRES+ images of (e)and (f). (i) Line profiles of UCNPs from the confocal image (c), raw NIRES image (e), and positive NIRES image (g). (j) Line profiles of UCNPs from confocal image (d), raw NIRES image (f),and positive NIRES image (h). Pixeldwell time for confocal and NIRES is 3 ms. The Pixel size for confocal andNIRES is 10 nm. The scale bar is 8 μm in (a)and 1.5 μm in (b) and 500 nm in (c) – (h).

1.结论与展望

与课题组之前报告低功率激发上转换STED超分辨成像相比，NIRES工作介绍了一种简单设计从而达到相同成像分辨率水平（<50 纳米）。较传统的多光子显微镜而言，NIRES提供了一个理想的简便稳定的工具，实现深层组织超分辨分辨率成像。课题组的目标是实现用低激光功率长波长超分辨率成像，即在活细胞实验中减少光毒性。随着上转换材料的合成控制，研究者们能更进一步的优化能量转移过程和荧光饱和特性来打破衍射极限。本课题为深组织的亚细胞结构超分辨成像和单分子追踪实验提供了一个简单的解决方案。

2.心得与体会

通过及时阅读跟踪研究领域的最近成果，可以更好的帮助研究者了解研究方向的发展，从而找到自己研究领域新的切入点。不过也要多跟别的研究领域的科研人员交流，这样可以拓宽思维，毕竟现在的研究大多数都是跨学科的工作了。而且跟非自己研究领域的人交流课题，往往会有意想不到的效果，有时候在自己领域是一个很难的问题，在别的领域里已经是很常见的手段了。多向他人请教学习，总会有很多意想不到的收获。科研工作总是面临很多困难与极限，因为我们是在不断挑战着不可能，所以请大家要保持好一个乐观的心态。最后与大家共勉：认真努力的人，都会有收获的，毕竟天道酬勤。

3.致谢

这个课题是课题组近期研究的一个主要方向，进展的比较顺利，主要得益于金大勇教授提供的高水平科研平台及王帆博士的辛勤指导，该课题也得到了北京大学席鹏老师及课题组其他成员的鼎力支持。特别是论文的后续生物组织实验补充是由悉尼大学Mike吴博士和UTS苏乾博士竭力帮助下完成，在此表示特别感谢。

通讯作者简历

#王帆博士#

王帆博士于2014年在澳洲新南威尔士大学获得博士学位。博士期间，他致力于研究光镊操作纳米颗粒的研究。之后，王博士于2013年加入澳洲国立大学Prof Chennupati Jagadish (澳洲物理工程学院院士，中国国家千人计划) 课题组，负责领导和管理光学方向。期间从事纳米激光，二维材料以及凝聚态物理的研究。从2015年开始，王博士开始转向生物光子学，加入了麦考瑞大学澳洲纳米光子学国家研究中心，以及金大勇课题组。期间负责领导课题组的生物光子学方向，博士生导师。并且开始帮助金大勇教授组建在悉尼科技大学的初始团队。王博士于2017年从研究中心离职，全职加入悉尼科技大学金大勇教授团队，以及生物材料器件中心（IBMD）, 继续担任生物光子学方向的负责人，博士生导师。

王帆博士一直致力于生物光子学，光子学，凝聚态物理等多学科，跨学科研究。从2010年起王帆博士一共发表了46篇文章，其中大部分文章都是分类排名5%以上的文章，包括Nature (IF~40), Nature Photonics (IF~37.9), NatureCommunications (IF~12), Nano Letters (IF~13), Advanced Materials (IF~19),Advanced Functional Materials (IF~11), ACS Nano (IF~13), Light: Science& Application (IF~14), Nanoscale (IF~7.4)。王博士的h-index超过19，文章平均影响因子超过10. 王博士作有丰富的博士生导师经验，他以第二作者以及第三作者身份帮助博士生发表了超过21篇文章。

#金大勇教授#

金大勇教授现任澳大利亚悉尼科技大学杰出教授，博士生导师，澳洲国家可集成生物医疗仪器与技术转化基地所长，澳大利亚悉尼科技大学生物医学材料及仪器研究所所长，澳大利亚国家自然科学基金委Future Fellow。金大勇教授近五年内作为通讯作者先后在《自然》及子刊中发表了十篇原创性工作（Nature 2017、Nature Nanotechnology 2013、Nature Photonics 2014 和 2018、Nature Communications 2014, 2016, 和2018、Light: Science & Applications 2016 和 2018），和三篇特邀综述展望（Nature Nanotechnology 2015，Nature Methods 2018 和 Nature Communications 2018），至今发表学术论文100余篇。同时他也是七项国际专利的发明人。专业领域涵盖了生物工程光学、生物医疗诊断、精密光机系统、仪表自动化等领域。凭着在交叉学科取得的卓越成就，他荣获2015年澳洲国家级科研最高奖尤里卡奖交叉学科创新奖。他也是2016年澳大利亚百名科技创新领军人物，和2017年澳洲科学院工程科学奖John Booker奖章获得者。2017年十月十八日，金大勇教授作为第一个华人科学家获得澳大利亚总理奖 - 马尔科姆·麦金托什年度物理学家奖Prime Minister's Prize for Science。