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撰稿 | 赵文琦 田筱超然
单分子荧光探测技术能够追踪生物体中单个分子的动态变化，有效挖掘出原本被大量生物统计信号掩盖的单分子信息，能极大地帮助研究者观察、理解生物过程的分子机理。因为能够避免可见光波段荧光信号被生物组织干扰而导致的信噪比下降问题，近红外波段的单分子荧光探测技术尤其具有重大的科学应用价值。然而绝大多数近红外荧光分子的荧光量子产率极低（小于10%），工作在该波段的探测器很难直接探测到它们所发出的荧光信号，因此如何增强近红外波段的单分子荧光信号是一个亟待解决的重要问题。
等离激元共振是金属中的自由电子在以特定频率变化的电磁场驱动下产生的集体振荡。等离激元共振纳米结构能够有效地实现能量在局域近场和远场辐射中的相互转换，因而适合作为与荧光分子耦合的纳米天线来增强分子荧光信号。由于荧光信号强度同时取决于分子被激发的强度和分子向外发射荧光的能力，一个理想的荧光增强结构需要同时满足荧光激发/发射过程的最优化要求，这对纳米天线的设计提出了很大的挑战。
图1 纳米天线增强荧光信号示意图
近日，复旦大学物理学系的谭砚文教授课题组和周磊教授课题组合作提出一种利用非对称纳米天线调制单分子荧光的方法，通过引入结构不对称性这一新自由度，突破了传统对称型纳米天线的限制，在保证荧光分子光稳定性的同时，显著提高了近红外波段的单分子荧光信号强度。
单分子荧光探测技术能够通过特异性地标记生物大分子，利用观测到的荧光信号追踪生物体内单个分子的动态变化，针对性地研究复杂生物环境中的特定分子动力学过程。由于生物组织在近红外波段对荧光探测的干扰显著降低，近红外波段有望成为高信噪比单分子荧光探测技术的工作窗口。但现阶段绝大多数近红外荧光分子的荧光量子产率都很低，这导致分子发出的荧光光子总数很少同时荧光分子的光稳定性差，极大地限制了单分子荧光技术在该波段的发展。
在之前的研究中人们已经发现，利用等离激元共振结构能够显著增强荧光分子所在位置的近场强度，从而将分子荧光强度增强约103倍。然而这类方法主要提升的是荧光分子被激发的速率，这将导致光稳定性差的荧光分子被快速漂白，失去荧光发射能力。更理想的方案是考虑对荧光激发/发射过程的同时增强，这要求等离激元共振结构既能够将激发光的能量很好地耦合到荧光分子上，又能够把分子发射的荧光很好地辐射到自由空间。然而，由于荧光分子的激发与发射过程发生在不同的波段，对传统的对称性纳米天线来说，这两个要求很难被同时满足。
针对上述挑战，本文所述研究工作设计了由两根不同长度的纳米金属棒构成的非对称结构（图2），利用不同长度金属棒各自具有的等离激元共振模式分别增强荧光分子的激发和发射过程。在模式匹配的基础上，结构引入的不对称性这一新自由度能够进一步调制等离激元共振的近/远场性质，同时满足增强荧光激发/发射过程的最优化要求，从而在不降低分子光稳定性的情况下实现更好的荧光增强效应。
图2 利用非对称棒状纳米天线增强近红外分子荧光
研究者通过电子束刻蚀方法制备出一系列不同尺寸的纳米天线阵列，再将溶有近红外染料分子AIEE1000的PMMA有机凝胶旋涂在纳米天线阵列上，在633纳米波长激光的激发下，利用全内反射荧光显微镜观测并记录分子的荧光信号。实验结果表明，随着结构不对称度的变化（以其中一根金属纳米棒的长度表示），荧光增强倍数存在最优表现的区间（图3a条状图）与理论预言（图3a蓝线）的趋势一致，实际观测到最高倍数为405的荧光增强现象。同时从CCD探测器接收到的图像中可以看到，在相同实验条件下，只有玻璃衬底（图3b）或存在对称型纳米天线（图3c右）时的分子荧光强度，整体而言都明显弱于被非对称纳米天线增强过的分子荧光强度（图3c左）。
图3 非对称棒状纳米天线增强近红外分子荧光的理论和实验结果
研究者的实验结果还显示：在相同激发强度下，经过非对称纳米天线增强的荧光分子具有比玻璃衬底上的荧光分子更长的漂白存活时间（图4）。这一事实进一步验证了非对称纳米天线在实现荧光增强的同时不会牺牲分子光稳定性的理论预言。
图4 纳米天线（彩色）/玻璃衬底（灰色）上荧光分子的漂白寿命对比
上述利用非对称纳米天线调制单分子荧光的方法，通过引入不对称性这一新自由度，在实现了近红外单分子荧光强度显著增强的同时，还提高了荧光分子的光稳定性，为单分子荧光探测技术在近红外波段的进一步发展铺平了道路。同时该研究成果对纳米天线增强荧光过程中物理机理的分析具有普适性，也为今后类似工作中纳米天线的设计提供了指导方案。
本文共同第一作者为上海复旦大学物理系博士生赵文琦、田筱超然和方浙宁，通讯作者为谭砚文教授和周磊教授。合作者包括上海大学通信学院的肖诗逸教授、复旦大学物理系的张远波教授和复旦大学化学系的李富友教授、冯玮教授。
该研究工作得到了国家自然科学基金委，科技部和上海市科委的支持。
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