探索互补型纳米超表面高灵敏抗原检测的奥秘

撰稿|姜远远、李法君

“互补”是一种广泛存在的科学范畴。互补的双方既相互联系，又相互区别。几何数学中的互补角，中国古代哲学的阴阳互补，自然界中生物碱基对互补都充分彰显了“互补”特性的普遍性及其在客观世界中强大的科学生命力。在纳米量级的微观世界中，同样存在具有互补特性的科学问题值得深入思考与研究。其中，纳米尺度互补型超表面的光学生物分子传感器领域涵盖物理、化学、生物、工程、医学等交叉学科背景下复杂的“互补”科学研究议题。在过去的二十年里，纳米棋盘、纳米蘑菇、纳米金字塔、纳米孔和纳米柱等多种等离激元超表面生物传感器得到普遍关注。在这些研究对象中，纳米柱和纳米孔超表面凭借低成本、大面积和可重复制造的优势而被广泛研究。等离激元纳米柱(PNP)和等离激元纳米孔(PNH)超表面在几何上具备典型的互补特性。然而，目前对这两种互补结构的生物传感器的性能研究还极为匮乏。

近日，厦门大学国家示范性微电子学院朱锦锋教授团队通过对PNP和PNH超表面进行了系统探索和比较研究，阐明了互补超表面独特的生物传感特性和表面近场生物分子定制化匹配机制，为等离激元生物传感的即时检测提供新思路。相关成果以“Exploring near-field sensing efficiency of complementary plasmonic metasurfaces for immunodetection of tumor markers”为题发表在国际期刊Biosensors and Bioelectronics（IF=10.618）上。

等离激元纳米柱和等离激元纳米孔超表面在几何上具有互补特性，往往被假定为同一类型的二维等离激元纳米光栅。本工作利用全波模拟研究了正入射下等离激元超表面的光学反射响应，并系统分析了电场分布和相应的等离激元效应。同时通过等离子体刻蚀、电子束蒸发、纳米压印等技术制备两种互补的PNP和PNH等离激元超表面（如图1 (a)、(b)所示）。使用光谱仪系统测量反射光谱，并与光学模拟结果进行比较，如图1(c)和图1(d)。两个互补超表面在正入射下的实验光谱均为(1,0)和(1,1)阶等离激元共振模式，与模拟结果相吻合。图1(c)和图1(d)的插图绘制了共振波长处的电场分布。PNP超表面(1,0)和(1,1)阶共振的电场高度集中在纳米孔侧壁，且在纳米孔顶部和底部边缘均存在明显的电场增强。PNH超表面(1,0)和(1,1)阶共振的电场集中在纳米孔附近并明显增强，(1,0)阶场比(1,1)阶场有更高的增强，且(1,0)阶场在电场最大位置附近的衰减长度在100 nm范围内。因而PNH超表面的(1,0)阶模式比其他模式有更大的场增强区域，表明其在生物分子传感方面有更大的潜力。

等离激元纳米柱和等离激元纳米孔超表面的体折射率灵敏度(BRIS)和表面折射率灵敏度(SRIS)已被广泛研究，用以评估其潜在的生物传感应用。该研究通过测量在去离子水、乙醇、异丙醇和乙二醇中的反射光谱，获得了BRIS值，如图2(a)所示。PNH超表面的BRIS为485.94nm/RIU，比PNP超表面高出约100nm/RIU。超表面用于生物分子检测时，使用SRIS比BRIS能更有效地评估生物传感性能。通过聚电解质分层(LbL)组装的方法生成厚度可控、均匀的带电共形聚合物层（如图2(b)所示），多次测量其反射光谱获得SRIS。该研究获取以共振波长位移与PAH/PSS双分子层数的函数关系，如图2(c)所示。结果表明，两种互补超表面的波长偏移随着生物分子层数的增加而逐渐增大。PNH超表面饱和波长位移为54.27nm，PNP超表面饱和波长偏移为36.38nm，这意味着前者具有更大的近场传感范围。仿真分析结果也较好地反映实验结果，如图2(d)所示。纳米光学电磁模拟分析表明PNP超表面的增强电场位于双分子层不紧密附着的底部边缘，降低了生物分子近场利用效率，而PNH超表面电场主要集中在纳米孔口周围，有利于提高生物传感近场利用效率，所以PNH超表面的SRIS更高。

图3(a)中给出了二阶SRIS与表面介质厚度的函数关系。结果显示，二阶SRIS都随着介质厚度从0nm增加到120nm呈指数衰减，而PNH超表面的二阶表面灵敏度始终高于PNP超表面。t=0nm时，PNH超表面的二阶灵敏度比PNP超表面高3.73 RIU^-1。图3(b)中绘制了(1,0)阶共振波长位移与待测牛血清蛋白抗体浓度的函数关系。采用四参数逻辑回归(4PL)方程拟合实验数据，PNP和PNH超表面的检测限（LODs）分别约为0.142ng/mL和0.078ng/mL。PNP超表面和PNH超表面的灵敏度分别为1.746ng/mL和1.300ng/mL。这说明PNH超表面具有较低的LOD、较好的生物分子灵敏度和较好的传感性能。

图3： (a) PNP和PNH超表面(1,0)阶谐振的二阶表面灵敏度曲线比较。(b)生物功能化超表面用于检测时，共振谱谷位移作为BSA抗体浓度的4PL函数。

多种肿瘤标志物的免疫检测是早期肿瘤筛查的重要手段，该研究侧重采用PNH超表面研究三种代表性肿瘤标志物CA 50、CA 19-9和AFP的传感效率。如图4(a)所示，为了检测目标肿瘤标志物，首先需引入生物功能层和蛋白抗体以捕获待测抗原分子。AFP抗体、CA 19-9抗体和CA 50抗体饱和固定后的共振波长分别有4.57nm、6.85nm和8.85nm的红移，如图4(b)所示。CA 19-9抗体和CA 50抗体的分子量分别是AFP抗体的2.2倍和2.8倍，而光谱红移分别是AFP抗体的1.5倍和1.9倍。研究结果表明，锚定抗体到超表面后引起的光谱红移量主要取决于抗体分子量的大小。

该研究测量了捕获三种目标抗原CA 19-9、CA 50和AFP后的光谱，把共振红移与抗原浓度的函数关系绘制在图5(a-c)中。三种抗原传感曲线的相关系数均在0.99以上，表明在一定的抗原浓度与共振波长之间具有很好的线性关系。与CA 19-9和CA 50抗体-抗原免疫检测体系相比，AFP抗体的衰减长度区域较小，可以更有效地检测AFP目标抗原分子。研究成果也表明人们在实际检测中需要采用较小尺寸的捕获分子和较大尺寸的目标分子，以确保高分子检测灵敏度。该研究工作最后检测了来自厦门大学第一附属医院不同CA 19-9、CA 50和AFP抗原浓度的血清样本，与商用化学发光免疫分析法（CLIA）的结果具有良好的一致性，检测限低于临床诊断阈值，展现了良好的应用前景。

图5： PNH超表面共振波长偏移与（a）CA19-9，（b）CA50和（c）AFP抗原浓度的函数关系。符号y和R²分别表示线性拟合函数和传感曲线相关系数。（d）CA19-9，（e）CA50和（f）AFP的临床血清检测结果。

以上报道系统研究了互补的PNP和PNH超表面，并比较了它们的等离激元生物分子传感性能，通过制备一对互补超表面，比较它们的体灵敏度和表面灵敏度。发现了抗体/抗原大小合适的AFP在肿瘤标志物的免疫检测中保持着最高的近场利用效率，同时基于人血清样本的灵敏度和特异性检测，为生物医学应用中各种生物标志物的检测和即时诊断提供了可靠的理论和实验研究依据。

厦门大学电磁声学研究院朱锦锋教授为该研究工作的通讯作者，课题组博士生李法君、申家情为本论文的共同第一作者，厦大附属第一医院林少唯医生和厦大药学院陈俊杰工程师为研究开展提供了协助。该工作得到国家自然科学基金(62175205)、国家自然科学基金联合基金项目（U2130112、U1830116）、福建省杰出青年科学基金(2020J06009)、应用光学国家重点实验室开放基金(SKLAO2020001A15)等研究经费的支持。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114038