（本文转载自：中科院长春应化所科技信息平台。本项工作的第一作者为博士研究生齐丽娟，杜衍研究员、李应福教授为文章的通讯作者。）
以验孕试纸为例，它是一种检测人绒毛膜促性腺激素(hCG)的侧向层析试纸条。由于hCG是验孕试纸的待测物，存在hCG时，会产生检测线和控制线两个条带；反之，只有控制线变红。杜衍研究团队首次利用蛋白质改性及融合技术，攻克了绒毛膜促性腺激素蛋白（hCG）与DNA偶联的难题，将hCG-DNA作为信号探针，实现了恶性传染病埃博拉病毒基因、黑色素瘤BRAF 单碱基错配基因以及新冠病毒的POCT定性/半定量分析，工作分别发表于Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56, 992-996、Anal. Chem. 2021, 93, 35, 11956–11964。并且，其团队利用核酸链置换技术，进一步将验孕试纸的检测分析物扩大至ATP、凝血酶等小分子的检测（Sensors & Actuators: B. Chemical, 2019, 288, 163-170）。利用验孕试纸条显色作为信号输出，在现有设备的基础上实现了分子诊断。验孕试纸的灵活性使开发快速POCT技术成为可能，提供了便携式分子诊断设备的新思路。
但是，当验孕试纸用于非hCG分析物检测时，通常需要四个步骤，包括在磁珠上制备传感界面、靶细胞孵育、磁性分离上清液并洗涤以及PTS测量等。实现这些检测的共同之处在于需要使用特殊底物来产生信号，或需要借助磁球等材料来分离反应产物，不利于实现终端的便携式诊断，不利于实现终端的便携式诊断。
基于上述问题，中国科学院长春应用化学研究所杜衍研究员课题组与麦克马斯特大学李应福教授团队合作利用1）简便快速、扩增功能强大的环介导等温扩增（loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）技术、2）特异性高的立足点介导核酸链置换技术、3）滚环扩增反应（rolling circle amplification，RCA）制备的微米级DNA纳米花（DNA NF）结构以及4）1:1单价态偶联的蛋白质核酸（hCG-DNA）标记技术，合作构建了基于商品化验孕试纸的免分离、一步核酸检测新技术。与乙肝病毒（HBV）药物拉米夫定（LAM）和恩替卡韦（ETV）相关的单碱基突变位点rtL180M作为靶基因，设计了特异性的hCG-DNA三通探针（L180M-3wj）并固定于DNA NF基底上。因DNA NF在试纸上不能流动的特性，从而不能在PTS上流动产生信号；当正确基因的扩增产物存在时，L180M-3wj探针中，标记着hCG的P1链被释放出来，从而在PTS上产生阳性信号。
(A) LAMP扩增产物示意图; (B) L180M-3wj与LAMP扩增产物反应示意图; (C) 商品化验孕试纸用于DNA NF辅助的HBV耐药突变基因一步诊断示意图
将不同浓度基因的LAMP扩增产物与3wj-DNA NF混合孵育，插入试纸条后2 min进行拍照。在靶基因rtL180M的LAMP扩增产物存在下，试纸条呈现明显的两条红线，可检测至2拷贝/微升；而在野生型基因rtWT存在时，其检测线与控制线的相对信号强度几乎与靶基因不存在时相近，表明该方法具有良好的灵敏度与特异性。并且，该检测在5%的血清中也没有信号的损失，体现了该检测平台的抗干扰能力。此外，在临床样本的测试中，试纸条检测结果与荧光检测法、直接测序法结果相匹配，表明该方法的可靠性与实际应用的潜力。
本方法具有以下优点：1）灵敏度高，可检测低至2拷贝/微升的基因；2）特异性好，能够高度区分HBV的野生型基因（rtWT）与rtL180M耐药突变型基因；3）可实现临床样本的检测，其结果与荧光法、直接测序法的检测结果一致，证明该方法的可靠性；4）3wj-DNA NF探针冻干后具有良好的室温存储能力，一个月后探针活性保持原来的82.3%。这是首次将PTS、LAMP、链置换技术与DNA NF结合起来，所构建的简便、免分离的“信号开”型核酸检测新方法，得益于DNA NF与L180M-3wj的高效杂交与LAMP扩增产物对hCG-P1的有效置换。鉴于其广普性，该平台可用于检测各种病原体和人类疾病相关的遗传变异。
本项工作的第一作者为博士研究生齐丽娟，杜衍研究员、李应福教授为文章的通讯作者。该工作发表于Angew. Chem. Int. Ed. 2021, doi.org/10.1002/anie.202108827。该工作得到国家自然科学基金、吉林省科技发展计划国际科学合作项目、加拿大自然科学与工程研究委员会等项目的资助。
