眼睛疾病的干细胞治疗- 大数跨境

中科睿极

2021-12-13

导读：视网膜损伤由于血管塌陷而造成的局部缺血缺氧会导致视网膜组织损伤和异常新生血管形成，需要加强缺氧性视网膜

1，视网膜损伤

由于血管塌陷而造成的局部缺血缺氧会导致视网膜组织损伤和异常新生血管形成，需要加强缺氧性视网膜神经组织血运的重建。在小鼠氧诱导视网膜病变（OIR）模型中，人iPS分化来源的内皮细胞玻璃体腔注射在胶原凝胶中形成了更为强健和复杂的血管网络，显著减少血管闭塞和病理性新生血管形成^[1]。

玻璃体腔内注射MSC（3x10⁵个细胞），可以减轻大鼠视网膜变性模型中碘酸钠（NaIO₃）对视网膜的损伤^[2]。给视网膜脱离的眼球中注射MSC后，视网膜ONL厚度接近正常视网膜，视网膜细胞凋亡显著减少，视网膜自噬被激活，有助于视网膜脱离后视网膜细胞在低氧和营养受限的环境中存活^[3]。

玻璃体腔内注射MSC和MSC来源的外泌体，均可以抑制炎症反应和修复视网膜损伤，从而改善视网膜损伤小鼠模型的视觉功能^[4]。早期糖尿病视网膜病变小鼠模型玻璃体腔内注射MSC的培养上清，同样可以观察到血管渗漏的减少和视力的改善^[5]。

大鼠骨髓MSC于眼球玻璃体注射，用于治疗视网膜缺血/再灌注模型大鼠，发现玻璃体注射的大部分MSC主要分布在内界膜上，只有少数细胞整合到神经节细胞层；MSC注射治疗后2周或4周，观察到少量MSC表达神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝（NF）和各种神经营养因子的标记物，从而保护了视网膜和视神经细胞的进一步损伤和死亡^[6]。对MSC进行基因改造，过表达色素上皮衍生因子（PEDF），除了发挥MSC减轻促炎细胞因子的功能和改善线粒体活性，还能借助分泌的PEDF恢复视网膜结构和功能^[7]。

建立光损伤视网膜大鼠模型，然后给与大鼠骨髓MSC（5μl的1x10⁶）视网膜下注射，可抑制光损伤眼光感受器凋亡，减缓视网膜损伤，MSC表达的BDNF因子对光损伤视网膜具有潜在的营养和保护作用^[8]。甚至静脉注射MSC亦可以通过降低炎症因子IL-1β和IL-6的表达和上调Occludin表达，从而减少糖尿病相关视网膜微血管渗漏^[9]。

MSC眼球局部注射治疗视网膜损伤的机理，除了消除眼球局部的炎症^[4]，还在于MSC可以靶向趋化到受损区域激活和促进视网膜祖细胞增殖^[10]，保护视网膜神经节细胞（RGC）和防止视网膜神经纤维层变薄^[11]，而且MSC增加了几种有效的神经营养因子的眼内水平，并减少了视网膜中的氧化损伤，但没有分化成神经或血管周围样细胞^[12]。

2018年报道的临床研究，对17例糖尿病患者的34只眼非增殖性DR（n=19）或增殖性DR（n=15）进行一次静脉输注3×10⁶/kg自体骨髓MSC治疗；输注MSC可显著降低FBG和CRP水平（P<0.05），但HbA1C和IL-6水平没有显著差异；在3个月和6个月的随访期内，非增殖性DR组患者眼睛的黄斑厚度减少，BCVA较基线检查时有显著改善，而增殖性DR组没有改善^[13]。

2，色素性视网膜炎

视网膜色素变性（RP）是由常染色体4或X-连锁突变引起的，这些突变导致感光细胞退化，导致视力丧失^[14]。尽管这些常规治疗改善了疾病预后，但需要反复给药以减少疾病进展，而且疗效有限。基因治疗只适用于那些由于特定突变而导致视力丧失的患者。静脉注射MSC亦能有效改善RP大鼠的视力^[15]。

一项前瞻性、开放性、3期临床试验于2019年4月至2019年10月在安卡拉大学医学院眼科进行，该研究包括32名色素性视网膜炎患者（34只眼）。患者在脐带MSC给药后随访6个月到1年，平均最佳矫正视力、平均视网膜外厚度、多焦视网膜电图和全场闪烁视网膜电图平均内隐时间均有不同程度的改善；随访期间未观察到与MSC治疗相关的眼部或全身不良事件^{[16, 17]}。

泰国团队开展MSC治疗色素性视网膜炎的非随机1期临床试验，招募了14名参与者，分别单剂量玻璃体内注射1×10⁶、5×10⁶或1×10⁷的MSC^[18]。在注射后的第一周内，两名受试者（14.28%）抱怨研究眼有轻度疼痛，一名受试者（7.14%）报告有压力，两名受试者（14.28%）红肿，四名受试者眼睛有轻度刺激，五名参与者（35.71%）描述偶尔看到闪烁或移动的灯光或圆点，未经治疗，所有症状在1周内自行消退，观察到1名患者出现轻微的黄斑囊样水肿和脉络膜轻微脱离。最佳矫正视力（BCVA）在随访期间有所改善，但在12个月时恢复到基线水平，VF和CST稳定，表明没有明显的疾病进展。

土耳其团队开展了一项前瞻性、单中心、3期临床研究，纳入82例色素性视网膜炎（RP）患者124只眼，通过外科手术将5x10⁶个脐带MSC注射到患者脉络膜上区域，均没有任何严重的全身或眼部并发症，在6个月的随访中，46%的眼睛视力改善，42%的眼睛保持稳定，12%的眼睛病情恶化，统计分析证实BCVA、VF和mfERG有较明显的改善（均P<0.05）^[19]。

同样，我国西南医院开展的32名色素性视网膜炎患者的I/II期临床试验中，所有患者接受静脉输注一次1x10⁸个脐带MSC，在第1、2、3、6、9和12个月的随访中，最佳矫正视力（BCVA）改善或维持的患者比例分别为96.9%、95.3%、93.8%、95.4%、90.6%和90.6%，即大多数患者在长期内改善或维持了视觉功能，而且前3个月生活质量明显改善^[20]。

3，老年性黄斑变性

年龄相关性黄斑变性（AMD）是最常见的导师视力丧失因素之一，其原因可能是视网膜色素上皮细胞（干性AMD）退化或脉络膜异常的新生血管（湿性AMD）。湿性AMD采用抗VEGF单抗治疗，可改善患者视力^[21]。相比之下，干性AMD患者可用于改善视力的治疗选择较少。

在老年性黄斑变性（AMD）小鼠模型中进行的人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞进行视网膜下移植，注射7个月后在注射部位没有检测到肿瘤生长^[22]，一些注射细胞在天然层上方形成视网膜色素上皮单层^[23]或整合到损伤部位的视网膜层中^[24]。

iPS与胚胎干细胞类似，具有多潜能分化能力，但不存在伦理问题。将人iPS分化为富含大量成熟感光细胞的视网膜组织，移植后在宿主视网膜中存活至少5个月（大鼠）至2年以上（猴子）；在7个移植的大鼠视网膜中，有4个在移植区域检测到RGC光反应；猴子移植后1.5年的视觉引导扫视（VGS）表现也表明光感轻度恢复^[25]。同样，在RP小鼠模型中，视网膜下移植iPS衍生的视网膜色素上皮细胞，注射治疗14天后，色素上皮衍生因子水平显著升高，小鼠的视网膜电图（ERG）和视觉行为改善比较明显^{[26, 27]}。有趣的是，来源于iPS的视网膜前体细胞（RPC）和视网膜色素上皮（RPE）细胞的联合移植优于单个细胞类型的移植，它在视网膜变性大鼠模型中产生了更好的视觉反应和视网膜ONL的保护^[28]。

将iPS诱导为视网膜色素上皮后，CRX+细胞占到72%，CRX+细胞移植到小鼠视网膜下时，CRX+细胞靠近内核层并与宿主视网膜的内神经元连接，其中约三分之一表达泛锥标记物Arrestin3，表明CRX+细胞在整合到宿主视网膜后进一步发育成熟^[29]。从患者血液中分离出CD34+细胞，将CD34+细胞诱导去分化为iPS细胞，iPS细胞再诱导分化为视网膜色素上皮（RPE）；与悬浮的RPE细胞相比，以聚乳酸-乙醇酸（PLGA）为基础的生物可降解支架与iPS-RPE结合，形成可移植的iPS-RPE补片，提高了大鼠和猪RPE损伤模型视力^[30]。

2015年2月份美国团队报道了9例Stargardt黄斑营养不良（年龄>18岁）和9例萎缩性年龄相关性黄斑变性（年龄>55岁）患者进行了两项前瞻性1/2期临床研究^[31]。对移植治疗患者进行了平均22个月的随访，与视力相关的生活质量指标在一般视力、周边视力、近距离活动方面有所提高，萎缩性年龄相关性黄斑变性患者移植后3-12个月的生活质量指标提高了16-25分，Stargardt黄斑营养不良患者的生活质量指标提高了8-20分；没有证据表明移植组织存在不良增殖、排斥反应或严重的眼部或全身安全问题，而不良事件与玻璃体视网膜手术和免疫抑制有关。

2015年5月份韩国团队报告了两名干性年龄相关性黄斑变性患者和两名Stargardt黄斑营养不良患者视网膜下移植人类胚胎干细胞分化而来的视网膜色素上皮的安全性和耐受性，随访1年没有存在不良增殖、致瘤性、异位组织形成或其他严重的安全问题，三名患者的视力提高了9-19个字母，一名患者的视力保持稳定（+1个字母）^[32]。

2018年英国团队设计了一种视网膜色素上皮细胞（RPE）贴片，该贴片包含一层完全分化的人胚胎干细胞（hESC）分化而来的RPE单层，位于一层的合成基底膜上，将贴片植入两名严重渗出性年龄相关性黄斑变性患者的一只眼视网膜下间隙，同时长期使用局部免疫抑制，通过生物显微镜和光学相干断层扫描术确定RPE贴片并存活12个月，两名患者的视力分别提高29和21个字母；然而，其中一名患者在随后的随访期间感光细胞功能下降，另一名患者发生视网膜脱离^[33]。

由两名晚期新生血管性年龄相关性黄斑变性患者的皮肤成纤维细胞诱导为iPS细胞，并进一步分化为RPE细胞，对其中一名患者进行了手术，包括去除新生血管膜和将自体iPSC衍生RPE细胞片移植到视网膜下；术后1年，移植片保持完整，最佳矫正视力未改善或恶化，黄斑囊样水肿；另一名患者因为在干细胞分化过程中出现了染色体的基因缺失，其中一个缺少是在X染色体上，因此科研团队放弃用iPS分化来的RPE治疗^[34]。

该团队对接受iPS分化来的RPE治疗一名患者进行四年随访发现，移植的自体iPSC衍生RPE片在视网膜下存活，色素区轻度扩张，无不良反应，在没有抗VEGF给药的情况下，视力保持稳定^[35]。

4，其他眼科疾病

韩国团队对四名外伤性视神经病变患者进行了一项I期、开放标签、单中心、非随机临床试验，结果发现与假手术组相比，MSC（5千万个细胞，眼筋膜囊内注射，在巩膜和Tenon囊之间）治疗组的Tuj1和Gfap基因表达水平显著升高，这提示MSC对视神经和视网膜神经节细胞具有保护作用，四名患者的视力均有改善；而且在12个月的随访期间，没有发现存在不良增殖、致瘤性、严重炎症或其他严重问题^[36]。我国重庆大坪医院团队开展1期临床研究来探讨脐带MSC注射治疗外伤性视神经病变（TON）的安全性和可行性，20例患者分别接受视神经管减压术联合MSC局部注射治疗或仅接受视神经管减压术治疗；经过6个月的随访，与基线检查时相比，两组患者的视力均有显著改善，然而，两治疗组之间没有统计学上的显著差异^[37]。

将MSC注入眼前房可更有效地降低眼压，促进青光眼小鼠模型的眼再生和修复^{[10, 38]}。巴西团队报道一项涉及两名晚期青光眼患者的临床试验，通过玻璃体内注射自体骨髓MSC，在12个月的随访中，没有一名患者的视力或视野有所改善，但其中一名患者在开始治疗两周后出现视网膜脱离^[39]。

我国天津医大眼科医院开展一项实验性临床试验，当患有难治性黄斑裂孔的患者进行眼睛玻璃体局部注射脐带MSC（2名患者）或来源于脐带MSC的外泌体（5名患者）后，观察到7名患者中有6名患者的BCVA改善和黄斑裂孔闭合，除另1名患者出现炎症反应外，未观察到任何不良反应^[40]。

5，不良反应

除了干细胞移植对视网膜疾病的保护和再生作用外，一些临床和临床前研究也报告了移植相关的不良反应。比如干细胞移植后出现的视网膜脱离^{[33, 41, 42]}，以及青光眼^{[39, 41]}，从而导致或加重视力丧失。MSC移植后出现的局部炎症，例如我国台湾某团队的实验研究，在前部缺血性视神经病变的大鼠模型中，MSC的玻璃体内移植导致视网膜损伤和严重炎症，并伴有巨噬细胞浸，MSC治疗组的视觉功能、视网膜功能和RGC密度显著降低^[43]。

MSC治疗反而引起炎症，那就应该考虑至少2个方面的影响，即实验操作和MSC细胞质量，而MSC质量最常见的影响因素是杂细胞比较多（纯度不够），可以从阴性表达的几个指标来判断。

在常染色体隐性RP的Pde6brd1小鼠模型中，视网膜下移植iPS分化而来的CRX⁺感光前体细胞，CRX⁺细胞融合入视网膜并分化成锥体细胞，从而改善视觉行为评分；然而，由于锥体和RGC之间出现了新的突触形成，导致移植后观察到“非常规”的光反应，可能反映了神经视网膜的异常重塑^[44]。另外，有研究观察到，玻璃体腔内注射脂肪MSC后，尽管神经视网膜的花环形成和凋亡减少，但电反应消失；而视网膜下间隙的脂肪MSC，则可以保护视网膜免受损伤和电反应的部分恢复^[45]。

需要非常注意的是，眼睛局部注射干细胞所引起的不良反应还是比较常见，而且有时比较严重，估计与局部注射的操作密切相关。关于干细胞治疗导致的严重不良反应，请阅读前期的文章《做好质控很重要：必须重视干细胞治疗的安全性》。

6，小结

目前，对于不同的视网膜病变疾病，均有不同种类的干细胞治疗。不同种类的干细胞，或发挥替代的作用（常见于ESC和iPS等），或发挥非替代的治疗作用（仅是MSC）。

可以动物实验和临床研究的数量和疗效来看，大部分眼科视网膜疾病都适合MSC治疗。MSC的治疗机制总结如下图。

需要注意的是，在大鼠模型中，即使使用不同的MSC细胞剂量和不同的注射次数，也总能提高角膜透明度、减少上皮缺损和减少新生血管。因此，为了更准确地比较结果，有必要研究来源相同但应用于同一动物模型的不同剂量和不同应用途径的作用，才能更好地明确哪种方案对该模型产生最佳结果。

简而言之，非常看好干细胞，尤其是MSC，在眼睛疾病的治疗应用前景！

【声明】内容源于网络

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